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Recuperação de produtos de Bioprocessos. Recuperação de produtos Operações down-stream Finalidade de uso: alimentos? medicamentos? diagnóstico? catálises.

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1 Recuperação de produtos de Bioprocessos

2 Recuperação de produtos Operações down-stream Finalidade de uso: alimentos? medicamentos? diagnóstico? catálises industriais? detergentes? Localização: (intra x extracelular)?? diversidade química e abundância de moléculas Custos

3 Recuperação de produtos Operações unitárias Operações unitárias -clarificação -rompimento de células -concentração e/ou purificação de baixa resolução -purificação de alta resolução -tratamentos finais -acondicionamento

4 Recuperação de produtos

5 CLARIFICAÇÃO Separação das células do meio de cultura Interesse no extrato ou no pellet de células?

6 Clarificação

7 Clarificação 1. Filtração Usado para grandes volumes de extratos diluídos Obtenção do filtrado e do retido (torta de células) Ausência de esterilidade* -microfiltração: 0,22 ou 0,45 μm Filtros convencionais: 100 μm Problemas com fouling Uso de pressão (vácuo). Materiais dos filtros: materiais celulósicos, terra diatomácea, materiais sintéticos

8 Torta de Células

9 Clarificação 2. Centrifugação Aceleração do processo de sedimentação por ação de um campo centrífugo Esterilidade Pellet mais úmido que na filtração Possibilidade de refrigeração Descontínuo ou contínuo

10 Tendo definido o processo, torna-se possível selecionar o tipo especifico de centrifuga. De um modo geral, as centrifugas podem ser divididas em centrifugas de filtração de sedimentação

11 Centrifuga de Discos

12 Centrifuga Decantadora de Vaso Horizontal

13 Centrifuga Tubular

14 Centrifuga de Cesta

15 Filtração Tangencial

16 Diminui tensão de cisalhamento da célula Diminuição da formação do fouling Processo usado em concentrações/purificações do produto Diferentes cut off. Materiais poliméricos

17 Filtração Tangencial

18 ROMPIMENTO CÉLULAR Para produtos intracelulares Romper ou permeabilizar? Cuidados com calor e proteases Diferentes composições de parede celular

19 ROMPIMENTO CÉLULAR

20 Métodos: Enzimáticos Usados para biomoléculas sensíveis a tensão de cisalhamento Necessidade de danos parciais Utilização de combinações de enzimas: Leveduras: glicanases, proteases e mananases Bactérias: glicosidadese proteases. Vantagens: fácil controle de pH e temperatura, alta especificidade. Desvantagens: custos, variação em função do estado fisiológico do micro-organismo.

21 ROMPIMENTO CÉLULAR 2. Mecânicos: Mais usados industrialmente. Equipamentos: homogeneizadores de alta pressão ( Prensa Francesa ) e moinho de coloidal, vortex* Mais baratos. Aumento de temperatura.

22 ROMPIMENTO CÉLULAR Moinho ColoidalMoinho de bola

23 ROMPIMENTO CÉLULAR 3. Não mecânicos: Choque osmótico, Congelamento/descongelamento, Ultra som

24 ROMPIMENTO CÉLULAR 4. Químicos: Detergentes, ácidos, bases Qual método usar dos 4? Rendimento, especificidade, controle de temperatura, custos.

25 PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS Natureza protéica dos produtos: enzimas, antibacterianos, anticorpos, etc. 1. Precipitação com sais : Método tradicional e simples Boa capacidade de separação de proteínas Fatores que determinam a estrutura e a solubilidade de uma proteína Princípio de ppt: perda da estrutura tridimensional Uso de altas concentrações de sal: salting out. -salting in!

26 Adição de sais reduz a disponibilidade de água, devido à hidratação dos íons do sal, reduzindo a disponibilidade de água (o que torna o meio mais hidrofóbico). Proteínas exibem diferentes graus de hidrofobicidade!!

27 PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS Faixas de saturação utilizadas Controle da temperatura durante adição do sal Controle do pH Centrifugação Suspensão em tampão Volume?? Recuperação de atividade Operação pós-suspensão Necessidade de eliminar o sal por diálise ou gel filtração?

28 PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS Sais para ppt: alta solubilidade pouco viscosidade em altas concentrações o ânion é mais importante na escolha -série de Hoffmeister (em ordem crescente de eficiência): nitratos < brometos< cloretos< acetato< sulfato< fosfato prefere-se cátions monovalentes: Na < K < NH4

29 PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS Sulfato de Amônio (NH4)2SO4 100% de saturação: 4 M (> 700 g/L) solubilidade elevada em amplas faixas de temperatura produz baixa viscosidade efeito anti-proteolítico e antibacteriano baixo custo concentração de proteínas Precipitação -60 g de sal em 100 mL de extrato (85% de saturação)

30 PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS Precipitação isoelétrica Alterar o pH até o ponto isoelétrico (PI)

31 PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS Precipitação por solventes orgânicos: -etanol ou acetona: reduzem a Aw, diminuem a constante dielétrica do meio, aumentando a interação entre cargas opostas de AA expostos Vantagens: redução da densidade do meio, favorecendo a sedimentação natural. Desvantagem: inativação da enzima, efeito de diluição, aquecimento

32 Precipitação por solventes orgânicos

33 Ultrafiltração Transporte de soluções através de membranas com poros de diâmetros entre 0,001 e 0,1 μm sob pressão. Usado para macromoléculas como proteínas e polissacarídeos. água e pequenas moléculas passam pela membrana, enquanto que as maiores, com diâmetro nominal (cut-off) maior, ficam retidas. cut-offs devem ser 20% menores que a molécula alvo. Vantagens: retira sais, concentração do produto, aplicável em grandes escalas. PROBLEMAS: fouling, custos, furos na membrana, formação de agregados, baixa resolução, EFICIÊNCIA!

34 Cromatografia Princípio: solutos de um meio líquido (enzimas, anticorpos, etc) são adsorvidos/retidos em um leito poroso. A posterior remoção gradual do soluto por ação deu uma fase móvel (eluente) resulta na separação das diferentes moléculas.

35 Cromatografia Configuração geral: - coluna-fase estacionária (matriz), que pode interagir química/eletricamente ou não apresentar interação com o produto, -fase móvel: tampão

36 Cromatografia 3.1. Troca Iônica uma das mais utilizadas processo baseado na afinidade que os componentes de uma amostra têm pelos sítios iônicos de uma matriz. a fase estacionária, eletricamente carregada, tem a capacidade de reter solutos que estão na fase móvel e apresentam cargas opostas

37 Troca Iônica Para ocorrer adsorção, controlam-se fatores como pH e força iônica. Trocadores: catiônicos (carregados -) ou aniônicos (carregados +)

38 Troca Iônica Eluição reversibilidade da ligação- as proteínas exibem diferentes números de sítios carregados na molécula, por isso seus graus de ligação à resina são variáveis. Formas de eluir: 1. Alteração de pH - diminuir pH em trocas aniônicas - aumentar o pH em trocas catiônicas. Problema: resinas tem boa capacidade tamponante.

39 Troca Iônica 2. Alteração da força iônica mais usado o desligamento da proteína da resina ocorre pelo deslocamento com outros íons (Na+ou Cl-, por exemplo), com a mesma carga adsorvida, porém com mais força de interação com a fase estacionária. Eluente mais usado: NaCl utiliza-se um gradiente crescente de NaCl

40 Troca Iônica

41 Vantagens da troca iônica -reprodutibilidade -alta resolução -concentração da amostra -rapidez Escalonamento -aumenta-se o volume da coluna -relação altura/diâmetro

42 Gel filtração gel permeação, cromatografia de exclusão molecular muito usada para purificação de enzimas, a separação ocorre baseada no tamanho (peso molecular) da enzima são usadas resinas inertes fabricadas em polímeros naturas (dextranas) ou sintéticos.

43 Gel filtração

44 Medidas das colunas -colunas largas e curtas: separação rápida, pouca turbulência e pouco resolução -colunas estreitas e compridas: separação lenta, maior resolução COLUNA IDEAL: a altura deve ter de 20–40 x o diâmetro.

45 Cromatografia de Afinidade Ligação específica do ligante (na resina) com a molécula alvo Extremamente seletiva

46 Cromatografia de Afinidade Tipos de interação específica: -antígeno/anticorpo -enzima/substrato -enzima/cofator -cauda de histidina proteínas recombinantes IMAC (Cromatografia de Afinidade por Metal Ionizado) Eluição: -detergentes, -mudanças na concentração de sal -aplicação de uma molécula com mais afinidade (eletrólitos)

47 Cromatografia de Afinidade

48 Eletroforese Usada para acompanhar as etapas de purificação Separação de proteínas pela ação de um campo elétrico que força o movimento de proteínas eletricamente carregadas através de um gel. As proteínas movimentam-se em função da quantidade total de cargas elétricas negativas (que é proporcional ao peso molecular), Após a corridaas proteínas são coradas com Comassie Blue ou com prata,

49 Eletroforese Aspectos práticos -Carregar a proteína negativamente (SDS) -eliminar pontes de dissulfeto (mercaptoetanol)

50 Tratamentos finais Qual o grau de pureza? acondicionamento liofilização, secagem inibidores de atividades indesejáveis Veículos de estocagem: glicerol, sorbitol, sacarose


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