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Eletroforese de Proteínas em Gel de Poliacrilamida 1-Introdução 2-Determinação da Malha no Gel 3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE 4-Visualização.

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1 Eletroforese de Proteínas em Gel de Poliacrilamida 1-Introdução 2-Determinação da Malha no Gel 3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE 4-Visualização das proteínas separadas por SDS-PAGE Edmar Vaz de Andrade

2 1-introduçao Poros (malha) com dimensões moleculares, onde a separação no gel ocorre de acordo com a filtração em gel e com mobilidade eletroforética das moléculas. Indicada para separação de: DNA Proteínas PAGE: Polyacrylamide gel electrophoresis Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

3 2-Determinação da Malha no Gel acrilamida N, N-metilenobisacrilamida Ligação cruzada Acri- Bis Acri-Bis: acrilamida ligada a N, N-metilenobisacrilamida Monômeros Polímero formado pela reação entre Acri-Bis

4 2-Determinação da Malha no Gel A polimerização entre Acri-Bis é catalisada por radicais livres APS: persulfato de amônio. Se decompõe naturalmente formando radicais livres. TEMED: estabiliza os radicais livres formados a partir do APS.

5 2-Determinação da Malha no Gel A formação do polímero entre acrilamida ligada a N, N-metilenobisacrilamida determina a dimensão dos poros formados (malha) no gel. Depende da quantidade de ligações cruzadas: Varia em função da concentração de acrilamida e N, N-metilenobisacrilamida

6 3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE

7 SDS-PAGE SDS: dodecil sulfato de sódio. Detergente aniônico forte. Interage com a proteína de modo independente da seqüência primária (proporcional a massa molecular) 1 molécula de SDS para cada 2 resíduos de aminoácidos Desnaturação da proteína: Aquecimento a 100 °C β-mercaptoetanol: agente redutor

8 3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE Desnaturação da proteína Ligaçao de SDS com a / proteína Efeito do SDS sobre as proteínas desnaturadas: Conformação linearizada Carga líquida negativa

9 3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE Gel separador Gel concentrador Aparato para eletroforese em SDS-PAGE

10 3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE

11 4-Visualização das proteínas separadas por SDS-PAGE Coloração por azul brilhante de Coomassie

12 4-Visualização das proteínas separadas por SDS-PAGE Coloração por azul brilhante de Coomassie Quitinase de Crhomobacterium violaceum expressa em Escherichia coli kDa


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