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Estratégias para purificação de uma proteína Os assuntos abordados nessa aula são: - Métodos de centrifugação e precipitação diferencial - Dosagem de proteínas.

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1 Estratégias para purificação de uma proteína Os assuntos abordados nessa aula são: - Métodos de centrifugação e precipitação diferencial - Dosagem de proteínas - Métodos cromatográficos - Análise de eficiência da purificação BIO Biofísica de Proteínas Regente: Célia R. Carlini Atenção ! Use o modo apresentação de slides para ativar as animações

2 Principais componentes moleculares da bactéria E. coli Componentes Nº de moléculas diferentes % peso total H 2 O 1 70 Proteínas Ac. Nucléico 1 - DNA e 1000-RNA 7 Carbohidratos 50 3 Lipídeos 40 2 Outros Íons Mol. Monoméricas A tabela acima mostra a percentagem em peso dos principais tipos de moléculas presentes em uma célula simples, a bactéria Escherichia coli. Observe que as proteínas compõem o grupo mais diverso de moléculas. Como são as proteínas que executam a maior parte das funções vitais de um organismo, uma grande parte das questões na Biologia envolve conhecer em detalhes a estrutura 3D e o funcionamento de uma proteína. Para se obter uma proteína em particular, é necessário separá-la de todas as outras que estão presentes na mesma fonte biológica.

3 Métodos de Isolamento de Biomoléculas O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D e a compreensão de suas propriedades biológicas. Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez. Métodos de purificação 1 proteína isolada Proteínas de uma célula

4 Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas: 1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação, diálise, gel-filtração) 2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese) 3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa) Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas moléculas: 4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que interage é um reagente de fácil obtenção, disponível comercialmente) Métodos de Isolamento de Biomoléculas Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas. Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis. Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:

5 ORGANELAS Lisossomos Mitocôndria Golgi Núcleo SOBRENADANTE F 1 F 2 F 3 F 4 F 2.1 F 2.2 F 2.3 F F F 2. 3.N Precipitação comSal/Solvente Precipitação comSal/Solvente Cromatografia Troca Iônica (pH ou resina diferente) F 2.3.N.X 1 Proteína apenas (0.001g) a 0.5% total Gel Filtração MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) O fluxograma ao lado representa a marcha de purificação de uma proteína, mostrando as etapas sucessivas, cada uma consistindo de método, que levam ao isolamento de uma proteína presente numa mistura complexa. Observe a quantidade de proteínas (100g) presente no material inicial e quanto da proteína purificada se obtém no final (0,001g). Esses números são típicos para a purificação da maioria das proteínas, em especial enzimas. Em cada etapa, a proteína de interesse é separada das demais com base em uma propriedade diferente. Consequente- mente, as proteínas ainda misturadas com aquela que está sendo isolada são cada vez mais semelhantes em suas características físico-químicas, exigindo métodos cada mais sensíveis, capazes de explorar pequenas diferenças, para se chegar à proteína pura.

6 Medida da atividade biológica - particular para cada proteína - deve ser quantitativa, para estimar quanto da proteína de interesse há em cada fração. Medidas do conteúdo proteico (diversos) - absorbância de luz UV de 280 nm - métodos colorimétricos (ex: Lowry, Bradford, BCA, etc) Além dos métodos de purificação, análises complementares devem ser feitas ao longo da purificação, para verificar se o processo de separação está sendo eficiente. A medida da atividade biológica da proteína de interesse e do conteúdo de proteínas de cada fração resultante do processo de separação devem ser feitas a cada passo. Assim, apenas a fração que contém a proteína de interesse, marcada com um círculo vermelho no fluxograma, é submetida à próxima etapa de purificação. ORGANELAS Lisossomos Mitocôndria Golgi Núcleo SOBRENADANTE F 1 F 2 F 3 F 4 F 2.1 F 2.2 F 2.3 F F F 2. 3.N Precipitação comSal/Solvente Precipitação comSal/Solvente Cromatografia Troca Iônica (pH ou resina diferente) F 2.3.N.X 1 Proteína apenas (0.001g) a 0.5% total Gel Filtração MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g)

7 Métodos para medida do conteúdo de proteína: O gráfico mostra o espectro de absorção de luz UV dos aminoácidos aromáticos Trp, Tyr ou Phe. A absorbância de uma solução de proteínas a 280 nm é diretamente proporcional ao seu conteúdo proteico, desde que essas contenham esses aminoácidos na sua composição, especialmente triptofano. A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que uma leitura de 1,0 A 280 equivale a uma concentração de 1 mg/mL. Comprimento de onda Absortividade molar,

8 BCA = ácido 2,2'-Bicinchonínico ou 4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline Reagente Bradford = Coomassie Brilliant Blue G-250 Método baseado em uma mudança espectral do reagente, em que dá absorção máxinma a 595 nm (cor azul), quando interage com proteínas. Interação com proteínas se dá através de forças de Van der Waals e ligações iônicas, especialmente com arginina, mas também com resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e fenlialanina. Ìons Cu 2+ reduzidos a Cu + em presença de proteínas reagem fortemente com o BCA formando um composto azul, Reagente de Biureto: sulfato de Cu 2+ em tartarato Cu 2+ reage com as ligações peptídicas e produz um complexo púrpura com absorção máxima em 540 nm 1. Cu 2+ é quelado pela proteína [Cu 2+ -proteina] 2. Reação redox Cu 2+ + (ligações peptídicas) > [Cu + -proteína] Ìons Cu 2+ reduzidos a Cu + em presença de proteínas e cadeias laterais de aminoácidos aromáticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o reagente de Folin-Ciocalteu (ácido fosfo- mobidênio-tungstênio), dando um composto de cor azul. Método de Lowry Métodos para medida do conteúdo de proteína:

9 Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc). tecidos células Homogeneização (para romper tecidos e células) por pressão (prensa francesa) liquefação (Potter) Homogenado ou Extrato bruto Material de partida Material na fonte por ultra-som com detergente Vários métodos são possíveis para transformar células, órgãos, tecidos em um homogenado, ou extrato bruto, como mostra a figura.

10 Sendo a proteína de interesse uma proteína de membrana, é necessário solubilizá-la. Para esse fim são utilizados detergentes, que dissolvem a membrana plasmática e formam complexos solúveis com as proteínas. Proteínas integrais da membrana detergente micelas Complexos não micelares Dependendo da concentração Detergentes podem ser iônicos e não iônicos Detergentes não iônicos Triton X-100 (polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol) SDS Dodecil sulfato de sódio Cetab Cetyltrimethylammonium bromide Deoxicolato de sódio Detergentes iônicos Octilglicosídeo (octyl-b-D-glucopyranoside)

11 sangue centrifugado: separação de plasma e células A centrifugação frequentemente é uma das primeiras etapas de purificação aplicado a um extrato bruto. Através do movimento de rotação do rotor da centrífuga, uma força centrífuga é aplicada à amostra, separando seus compo- nentes através de suas massas e/ou densidade, conforme a técnica. Através de sucessivas etapas de centrifugação com velocidades (rotações por minuto, rpm) crescentes, pode- se obter diferentes frações de um homogenado de células ou tecidos. centrifugação diferencial homogenado células intactas pedaços de membrana núcleos mitocôndrias lisossomos ribossomos fração citoplasmática A centrífuga Câmara blindada Amostra sedimentando refrigeraçãovácuo rotor ângulo fixo

12 R$ 3.000US$ 70,000 Centrífuga Clínica Ultracentrífuga Força centrífuga 1,200g por 15 minutos separa plasma de células sanguíneas 200,000 g por 24 horas para separar organelas menores ou complexos proteicos (necessitam vácuo para evitar atrito do ar, além de refrigeração) Relação entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a força centrífuga (g) Preço aproximado Existem centrífugas para diferentes tipos de aplicações, dependendo da força centrífuga que são capazes de gerar.

13 Centrifugação em gradiente de densidade Solucões de sacarose com densidades diferentes são colocadas no tubo, uma sobre a outra Amostra é colocada no topo do gradiente 5% sacarose 20% sacarose centrifugação Baixa densidade Média densidade Alta densidade A centrifugação em um meio com gradiente de densidade melhora a eficiência da separação. As partículas se deslocarão através do gradiente até encontrarem uma região com densidade equivalente a sua, quando param de se mover, formando bandas. Gradientes podem ser utilizados para separar diferentes tipos de células, organelas, ácidos nucléicos, complexos proteicos, etc. Gradiente separação de: Ficoll-Hypaque leucócitos Sacarose mitocôndrias Cloreto de césio ácidos nucléicos

14 As mais potentes ultracentrífugas atuais ainda não são capazes de sedimentar proteínas. Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitação fracionada de proteínas são utilizados como etapas preliminares de purificação. Uma das vantagens desses métodos é o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas. A precipitação de proteínas pode ser induzida por: - adição de sais (Precipitação salina) - adição de solventes - variação de pH (Precipitação isoelétrica) Solubilidade da hemoglobina (S/S) KCl NaCl MgSO 4 (NH 4 ) 2 SO 4 K 2 SO4 Concentração do Sal,, Molar Salting-in X Salting-out O gráfico ao lado ilustra o efeito de diferentes sais sobre a solubilidade da hemoglobina. Em baixa concentração salina, a solubilidade das proteínas aumenta, pois os íons do sal ajudam a reforçar a camada de solvatação. Em alta concentração salina, a solubilidade das proteínas diminue pois os íons do sal competem pelas moléculas de água disponíveis para formar a sua própria camada de solvatação. Sais com ânions divalentes são mais eficientes do que os monovalentes na precipitação de proteínas.

15 Solubilidade, log Fibrinogênio Pseudoglobulina MioglobinaAlbumina Hemoglobina Concentração do Sal (NH 4 ) 2 SO 4,, Molar Sais se dissociam em solução aquosa e competem com as proteínas pela água de solvatação. Considere uma solução com fibrinogênio, albumina, hemoglobina, pseudoglobulina e mioglobina e observe o gráfico. Usando o sal sulfato de amônio (NH 4 ) 2 SO 4, pode-se purificar completamente o fibrinogênio a partir de uma mistura das 5 proteínas, pois este precipita totalmente em uma saturação de 2,8 M do sal. Neste ponto, centrifuga-se a solução e o fibrinogênio é coletado como um precipitado. Numa próxima etapa, adicionando-se mais sal à solução até uma saturação de 7 M, pode-se obter um novo precipitado contendo albumina, hemoglobina e pseudoglobulina. E teremos também purificada a mioglobina, ainda em solúvel na presença de 7M do sal, e que ficou sozinha no sobrenadante. Proteínas apresentam diferente sensibilidade para a precipitação salina. - precipitam primeiro: proteínas maiores proteínas mais hidrofóbicas possuem camadas de solvatação maiores ou menos organizadas, mais fáceis de pertubar.

16 Solventes miscíveis com a água diminuem a constante dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação das proteínas. Os mais utilizados são etanol e acetona. Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico. Água Dimetilformamida Metanol Etanol Acetona Clorofórmio Benzeno Solvente Constante Dielétrica Momento Dipolar Proteína P.I. Pepsina <1,0 Ovalbumina galinha 4,6 Albumina sérica humana 4,9 Tropomiosina 5,1 Insulina bovina 5,4 Fibrinogênio humano 5,8 Gama-globulina 6,6 Colágeno 6,6 Mioglobina equina 7,0 Hemoglobina humana 7,1 Ribonuclease A bovina 7,8 Citocromo C equino10,6 Histona bovina10,8 Lisozima, galinha11,0 Salmina, salmão12,1 Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu PI tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam a camada de solvatação menos organizada.

17 Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise. -amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d. - o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja - excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente - após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado. Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é necessário reverter as condições que levaram à precipitação. Membrana de celofane solvente solução a ser dialisada Aos precipitados obtidos com sal ou solvente, adiciona-se água. Ao precipitado obtido com variação de pH, retornar ao pH original. início final t

18 ORGANELAS Lisossomos Mitocôndria Golgi Núcleo SOBRENADANTE F 1 F 2 F 3 F 4 F 2.1 F 2.2 F 2.3 F F F 2. 3.N Precipitação comSal/Solvente Precipitação comSal/Solvente Cromatografia Troca Iônica (pH ou resina diferente) F 2.3.N.X 1 Proteína apenas (0.001g) a 0.5% total Gel Filtração MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) Até o momento, exploramos as etapas iniciais de purificação de proteínas, como a centrifugação diferencial e precipitação fracionada. Esses métodos, apesar de terem baixo poder de resolução (exploram diferenças grosseiras entre as proteínas), permitem processar grandes volumes ou massas, típicos das etapas iniciais de isolamento. Quando já houve redução significa- tiva dos montantes de proteínas a serem processados, iniciam-se as cromatografias, que irão explorar as diferenças mais sutis entre as moléculas. Não esquecer que todas as frações obtidas devem ter o conteúdo de proteínas e de atividade biológica medidos, para se decidir qual/quais deverão passar para o passo seguinte da purificação.

19 Concentração Tempo ou volume Coletor de frações Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão), banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas. Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia: Tempo 1 Mais tampão é colocado na coluna, forçando os componentes da amostra a interagirem com a resina Componentes da amostra se separam e saem da coluna com diferentes volumes de tampão Tempo 2Tempo n Líquido que sae da coluna é recolhido em tubos de um coletor de frações Os componentes da mistura são separados por interação diferenciada com a resina, com base em propriedades moleculares como: massa molecular carga elétrica solubilidade afinidade Amostra com diferentes componentes Resina embebida em tampão Tempo zero Um cromatograma, como o gráfico ao lado, é a maneira usual de se representar o resultado de uma cromatografia.

20 Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ? Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração: separação de moléculas pela massa molecular géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros Cromatografia de troca iônica: separação de moléculas pela carga elétrica géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica): separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso géis possuem carácter hidrofóbico Cromatografia de afinidade: separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante géis possuem ligante específico ligado covalente à resina

21 Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular grãos (beads) da resina com poros grão da resina poroso proteína grande proteína pequena Tampão empurra moléculas através da resina tubos Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída. Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de volume morto (Vo). Proteínas menoresnão são separadas Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel). Moléculas com massas diferentes Fluxo do tampão

22 Absorbância a 280 nm volume Medida da ativ. biológica Moléculas maiores Moléculas menores Kav Massa molecular (kD) mL mL volume de eluição A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de uma proteína em seu estado nativo Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo. Para isso, é necessário calibrar a coluna com proteínas de massa molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração. O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel- filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular. Curva de calibração traçado da medida de atividade biológica nas frações Medir o volume de eluição da fração mais ativa. Transportar para a curva de calibraçao. Ler a massa correspondente Observa r a escala log

23 Moléculas pequenas Proteínas Células, partículas sub-celulares Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo de moléculas ou partículas a serem separadas indica quais os tamanhos das partículas que podem entrar nos poros da resina e serem fracionados. Acima ou abaixo da faixa, não há separação.

24 Para comparar calibrações com a mesma resina cromatográfica em colunas de dimensões diferentes utiliza-se o Kav, que é proporcional ao log de Mr. Kav = Ve-Vo Vt-Vo Ve – volume de eluição de uma certa proteína Vt – volume total da coluna Vo – volume morto da coluna, em que saem moléculas com massa acima da resolução da resina onde: O gel nessa coluna é o Sephadex G-200, cuja faixa de resolução de proteínas é de a d. Observe como proteínas nos extremos da faixa de resolução tendem a sair da parte linear da curva. Esta é uma outra forma de representar a calibração de uma coluna de gel-filtração.

25 Cromatografia de troca iônica A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou negativa, em uma ampla faixa de pH. Trocadora de ânions Trocadora de cátions DEAE CM Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva), como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose

26 O gráfico mostra que essas resinas mantém suas cargas em uma ampla faixa de pH. Assim, o DEAE-celulose pode ser utilizado em pH abaixo de 10, enquanto que o CM-celulose é utilizado em pH acima de 4, condições em que pelo menos 50% dos grupos dessas resinas estão carregados. Cromatografia de troca iônica

27 Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica Adsorção Eluição Moléculas com a mesma carga, ou sem carga, não interagem com a resina, sendo as primeiras a sair da coluna Adição de sal ao tampão resulta em competição entre os íons em solução e as moléculas adsorvidas na resina. Na + Cl - + A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: 1)adsorção das proteínas com carga contrária à resina, e saída da coluna das proteínas com a mesma carga; 2)eluição das proteínas adsorvidas No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou trocadora de ânions, como o DEAE-celulose): Para a eluição, as condições de adsorção da coluna (pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a interação entre as proteínas e a resina. Mais frequentemente utiliza-se um aumento da concentração do sal no tampão, pois alterações de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a precipitar dentro da coluna.

28 PI ácido + básico - neutro -COOH -COO -NH 3 H H + -NH 2 Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica O processo da cromatografia de troca iônica depende da diferença de ponto isoelétrico das proteínas na amostra e das condições escolhidas de pH e de força iônica. Proteína P.I. Pepsina <1,0 Ovalbumina galinha 4,6 Albumina sérica humana 4,9 Tropomiosina 5,1 Insulina bovina 5,4 Fibrinogênio humano 5,8 Gama-globulina 6,6 Colágeno 6,6 Mioglobina equina 7,0 Hemoglobina humana 7,1 Ribonuclease A bovina 7,8 Citocromo C equino10,6 Histona bovina10,8 Lisozima, galinha11,0 Salmina, salmão12,1 Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas Proteínas apresentam carga positiva quando em meio ácido em relação ao seu PI, e carga negativa, quando em meio alcalino em relação ao seu pI. Nesse caso, a referência para se dizer que o meio é ácido ou básico é o PI da proteína, e não o pH do meio. A carga das proteínas varia em função do pH do meio, pois o pH influencia o estado de dissociação das cadeias laterais dos aminoácidos ácidos e básicos. Responda: em pH 7,0, qual será a carga elétrica da albumina, da mioglobina e do citocromo C ?

29 Carboximetil~celulose (trocadora de cátions) Dietilaminoetil~celulose (trocadora de ânions) Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do tampão de eluição. As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas, sendo simplesmente arrastadas pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina). _ = = _ (+) M M M Eluição NaCl Não retidas DEAE M M M Eluição NaCl + (-) _ = = _ Não retidas CM

30 Tipos de Resina de troca Iônica Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado. NOMETIPOGRUPO IONIZÁVELOBSERVAÇÕES Dowex 1Fortemente básicaØ-CH 2 N + (CH 3 ) 3 Troca aniônica resina de polistireno Dowex 50Fortemente básicaØ-SO 3 -H-HTroca Catiônica resina de polistireno DEAE-celuloseBásicaDietilaminoetilFracionamento de proteínas -CH 2 2 N + (C 2 H 5 ) 2 ácidas e neutras CM-celuloseÁcidaCarboximetilFracionamento de proteínas -CH 2 COOHbásicas e neutras DEAE-SephadexGel de dextranoDietilaminoetilCombinação de gel filtração básico-CH 2 2 N + (C 2 H 5 ) 2 e troca iônica de proteínas ácidas e neutras CM-SephadexGel de dextranoCarboximetilCombinação de gel filtração ácido-CH 2 COOHe troca iônica de proteínas básicas e neutras * Dowex: Dow Chemical Co.; Sephadex: Amersham Pharmacia Biotech; Bio- Gel: Bio Rad Laboratories

31 Cromatografia de afinidade: Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou por competição com o ligante livre Desprezar proteínas não retidas Lavagem Eluição pH 2,0 ou sal Antígeno A puro Anti-A interage apenas com a proteína A - Mistura de proteínas Coluna empacotada com esse gel Partículas de gel recobertas de anticorpos anti-A Adsorção Complexo Ag-AC é desfeito Um dos métodos mais eficientes para a purificação de proteínas, possibilitando um alto rendimento com número reduzido de etapas. A separação de moléculas tem como base a interação específica do analito (molécula-alvo) com um ligante imobilizado na matriz. Forças envolvidas nessa interação podem ser não covalentes (eletrostáticas, hidrofóbica, pontes de H) ou covalentes (p.e., ponte dissulfeto). Ex: cromatografia de imunoafinidade

32 Ligante grupo-específico Especificidade Proteína ARegião Fc de IgG Proteína GRegião Fc de IgG Concanavalina AGrupos glicosil- ou manosil- Cibacron BlueVárias enzimas, albumina lisinaPlasminogênio, RNA ribossomal argininaproteinases tipo tripsina benzamidinaproteinases tipo tripsina calmodulinaProteínas reguladas por calmodulina heparinaFatores de coagulação, lipases, hormônios, receptores estoróides, etc Metais de transiçãoProteínas e peptídeos com resíduos de His expostos 1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo - análogos de substratos ou inibidores de enzimas - agonistas ou antagonistas de receptores - haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos - ligantes com tag ou marcação - glutationa-S-transferase - poli-Histidina 2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos: Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade 8-AEA-cAMP 8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic monophosphate (ligante para proteínas com afinidade por cAMP ou cGMP) Sítios de ligação das proteínas A, G e L à imunoglobulina, que permitem a purificação de anticorpos por cromatografia de afinidade

33 Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade ou impede sua ligação à resina. A introdução de um braço espaçador (alguns C) diminue o risco. Estratégias para acoplamento de ligantes à resina Reagente Alvo no ligante Braço espaçador covalente entre a resina e o ligante Ligação reversível não covalente ligante Molécula-alvo (analito) Preparo da resina de afinidade: Passo 1. Ativação da resina Passo 2. Acoplar o ligante

34 Cromatografia de Partição Princípio: Explora diferenças de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade diferentes, um polar e outro apolar. Aplicável especialmente á moléculas pequenas, como compostos orgânicos, aminoácidos, peptídeos, açúcares, lipídeos, etc. Apresenta limitações para uso com proteínas acima de 20-30kda, que são desnaturadas em presença de solvente orgânico. AMOSTRAS Fase estacionária (suporte sólido) X Fase móvel (líquido ou gás) - Amostra se deslocará (é mais solúvel) acompanhando a Fase Móvel Duas Possibilidades - Amostra não se deslocará (é mais solúvel) na Fase Estacionária Consiste de 2 sistemas: Suporte: PAPEL Fase Estacionária: Aquosa (H20 na celulose ) Fase Móvel: Solvente orgânico (hidrofóbico) CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO Suporte : GEL DE SÍLICA (camada delgada ou TLC) CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA Fase Estacionária: sílica (mineral apolar) Fase Móvel: Solvente aquoso ou água Dois tipos de montagem:

35 Para um dado sistema de solvente e tipo de suporte, cada substância apresenta um valor de Rf característico. Assim, além de um método de purificação, as cromatografias de partição permitem identificar e quantificar (pela intensidade das manchas obtidas após a separação) diferentes compostos. Pode-se ainda recortar a mancha de interesse do papel ou da sílica e recuperar o composto isolado. Cromatografia de Partição distância de migração da substância distância de migração do solvente R f = Papel ou placa de sílica Amostra na origem tempo 0 t 1 t2 tn direção do fluxo do solvente Compostos separados Cuba com solvente (fluxo por capilaridade)

36 HPLC: high performance (pressure) liquid chromatography Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em dia abrange aplicações para todos os tipos de cromatografias. Característica diferencial da cromatografia convencional: partículas de resina com diâmetro muito pequeno (poucos microns) aumento da eficiência da separação em função do número maior de grãos de resina em um mesmo volume da coluna fase móvel - necessita bomba de alta pressão para ter fluxo através da coluna Desenho básico de um HPLC bombas Injetor de amostra Coluna e forno Coletor de frações Detector Controle e análise dos dados Duas bombas permitem eluição em gradiente Detector: índice de refração, absorbância UV ou Vis, fluorescência, etc. Coluna pode ser aquecida para melhorar a eluição diferencial na fase reversa

37 CN Fenil NH2 C4 C8 C18 Retenção na coluna: aumenta com o tamanho da cadeia Condição de equilíbrio: em meio ácido (0.1% de ácido trifluoroacético) para aumentar hidrofobicidade (protonar as carboxilas) Eluição com gradiente crescente de solvente orgânico miscível com água - acetonitrila, metanol, propanol Fase reversa: resinas de sílica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C Fase estacionária Função C18 –Si (CH 3 ) 2 C 18 H 37 C8 –Si (CH 3 ) 2 C 8 H 17 tC2 –Si C 2 H 5 Aminopropyl –Si (CH 2 ) 3 NH 2 Cyanopropyl –Si (CH 3 ) 2 (CH 2 ) 3 CN Diol –Si (CH 2 ) 3 OCH 2 CH(OH)CH 2 OH Absorbância a 214 nm Tempo ou volume de retenção % de acetonitrila 100 Moléculas não retidas Moléculas retidas Cromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluição por um gradiente de acetonitrila

38 Cromatografia de interação hidrofóbica É um processo de partição que explora a interação entre aminoácidos apolares de uma proteína e uma matriz de carácter hidrofóbico. Proteínas em solução salina concentrada perdem parte da camada de solvatação para os sais, expondo na superfície regiões ricas em aminoácidos apolares, que interagem com uma matriz hidrofóbica Eficiência dos sais em provocar salting-out varia com a série de Hofmeister: Ânions: PO4 -2 > SO4 -3 >CH3COO - >Cl - >Br - >NO3 - >ClO4 - >I - >SCN - Cátions:NH4 + >Rb + >K + >Na + >Cs + >Li + >Mg + >Ca + >Ba + Três estratégias para eluição: 1. diminuir a concentração de sal 2. diminuir a polaridade da fase móvel 3. adicionar detergente Força da interação hidrofóbica aumenta com o tamanho da cadeia de C na resina: Fenil (C6-OH) > Butil (C4) > Octil (C8) P Proteína altamente hidrofílica P Proteína menos hidrofílica camada de H 2 O solvatação H matriz hidrofóbica volume [Proteína] [sal]

39 Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ? Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína: - Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação. - Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína de interesse foi concentrada. Calcula-se como a razão entre as atividades específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura). - Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser proces- sadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas que apresentam pouca atividade). Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de interesse.

40 Purificação da Glicoquinase hepática de Rato Etapa Atividade Específica b b ( U ( U.mg -1 ).. - a Rendimento c ( % ) Marcha A: somente cromatografias convencionais 1.Sobrenadantede pâncreas 2. (NH4) 2 SO 4, precipitado 25-55% 3. troca iônica, coluna DEAE-Sephadex, pH 7.0,eluiçãoKCl 4. troca iônica, colunaCM-cellulose, pH 5.5,eluiçãoNaCl 6. interação hidrofóbica, coluna Butyl~Sepharose 7. gel-filtração, colunaSephacrylS Marcha B: com cromatografia de afinidade 1.Sobrenadantede pâncreas troca iônica, coluna DEAE-Sephadex, pH 7.0,eluiçãoKCl Afinidade cromatográfica ( benzamidina~agarose ) Índice b b Purificação a U nidade de enzima (1 unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima que cataliza a transformação de 1 micromol de substrato em produto, em condições pre-estabelecidas b Atividade específica: medida da atividade biológica (em U) expressa por miligramas de proteína c Rendimento: percentual da atividade biológica inicial (100%) recuperada em cada etapa de purificação d Índice de Purificação: razão entre a atividade específica inicial e aquela determinada em cada etapa. Uma tabela como a vista acima é a maneira usual de se descrever o resultado de uma purificação. No exemplo acima, a mesma proteína foi isolada por duas marchas diferentes de purificação (A e B). Observe os parâmetros de purificação. Se você fosse repetir essa purificação, qual esquema de purificação escolheria ? EU TERIA ESCOLHIDO A MARCHA B.

41 Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ? A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) permite visualizar a composição de proteínas de uma amostra. É um método complementar para a purificação de proteínas. Fornece informações sobre a massa molecular e composição de subunidades da proteína em meio desnaturante e redutor. A poliacrilamida é um polímero que um gel de malha porosa. A poliacrilamida funciona como uma peneira, deixando passar através de seus poros as moléculas pequenas e retendo as grandes poliacrilamida Catalisador (persulfato de amônio) + acrilamidaN,N´-metilenobisacrilamida É formado a partir da reação de acrilamida e bisacrilamida. concentração de acrilamida variando de 5 a 20% determina o diâmetro dos poros uso de gradiente de acrilamida aumenta o poder de resolução o gel é polimerizado com tampão pH 8.9, na presença do detergente Na + dodecil sulfato (SDS)

42 H 3 C-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 - Sódio dodecil sulfato Desnaturação de proteínas por SDS Efeito do SDS desnaturação uniformiza a forma das proteínas, que poderia influenciar na migração através dos poros da poliacrilamida; mascara a carga natural das proteínas no pH da corrida, fazendo com que todas moléculas migrem para o anôdo; facilita o efeito de redutores, rompendo pontes dissulfeto intra- e inter-cadeias A porção hidrocarboneto do detergente interage com as regiões hidrofóbicas da proteína, dispondo o grupo sulfato carregado na superfície, em contacto com o meio aquoso. A repulsão entre os grupos fosfato desestabiliza os laços não covalentes que mantém a estrutura 3D da proteína, desnaturando-a.

43 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE) cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm) O desenho ao lado mostra o tipo mais comum de cuba para PAGE. Na cuba, o gel é polimerizado entre duas placas de vidro ou plástico, afastadas 1 mm uma da outra. Antes da polimerização, um pente é colocado na parte superior do gel para formar os poços onde serão colocados de 5 a 20 microlitros de cada amostra, misturadas com azul de bromofenol, um indicador da corrida. As partes superior e inferior do gel fazem contacto com recipientes de tampão, onde estão os eletrodos que estabelecerão o campo elétrico (~100V) durante a corrida (1 a 2h). Terminada a corrida, as placas são retiradas da cuba, e o gel entre elas é cuidadosamente retirado e corado para revelar as bandas de proteína. Como corantes utiliza-se Coomassie Blue ou nitrato de prata. catodo anodo tampão Poços para as amostras amostra Placas de vidro 1 mm tampão gel

44 Adição do redutor 2-mercaptoetanol rompe pontes dissulfeto nas proteínas, possibilitando a determinação do número de cadeias e tipo de ligação entre cadeias de proteínas oligoméricas Padrões AB A B SemCom 2 - Mercaptoetanol B s s SH A BA Eletroforese em Meio Redutor SDS-PAGE das proteínas da bactéria Salmonella tiphymurium Direção da migração Cada linha (banda) corada no gel representa uma proteína

45 SDS-PAGE permite determinar a massa molecular de proteínas Mobilidade relativa Massa molecular (kD) Mobilidade relativa = distância percorrida pela banda X distância percorrida pelo marcador da corrida (-) (+) Curva de calibração de SDS-PAGE A migração eletroforética, expressa como mobilidade relativa, é proporcional ao logaritmo da massa molecular. Utiliza-se proteínas padrões com Mr conhecida para se fazer uma curva de calibração do gel em cada corrida. Interpolando-se a mobilidade relativa de uma proteína desconhecida na curva, pode-se estimar a sua massa molecular. Proteínas padrões em um SDS-PAGE Mr

46 Terminamos aqui a 4ª.aula online do curso de Biofísica de Proteínas. Os assuntos abordados nessa aula são: - Métodos de centrifugação e precipitação diferencial - Dosagem de proteínas - Métodos cromatográficos - Análise de eficiência da purificação Na aula prática, vocês terão oportunidade de ver alguns tipos de cromatografia funcionando.


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