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Determinação da concentração e da pureza do DNA por espectroscopia UV e gel de agarose.

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Apresentação em tema: "Determinação da concentração e da pureza do DNA por espectroscopia UV e gel de agarose."— Transcrição da apresentação:

1 Determinação da concentração e da pureza do DNA por espectroscopia UV e gel de agarose

2 GeneQuant Determinação da concentração e da pureza do DNA

3 Determinação da concentração

4 Nanodrop 104,5ng/ l = 0,104 g/ l

5 Determinação da concentração do DNA extraído por espectroscopia As amostras de DNA obtidas no laboratório devem ser avaliadas quanto à sua concentração e à sua pureza por meio da densidade óptica (DO) em espectrofotômetro. O DNA absorve luz no comprimento de onda de 260 nm e as proteínas, de 280 nm. Para leitura no espectrofotômetro as amostras de DNA são preparadas (diluídas) com água ultrapura: ex: 10 L de DNA em 490 l de água (diluição 1:50) ou 5 L de DNA em 495 l de água (diluição 1:100) ou de acordo com o volume necessário para leitura no equipamento.

6 Determinação da concentração do DNA extraído Para estimar a concentração de DNA, utiliza- se a seguinte relação: 1 DO 260nm = 50 g de DNA de dupla fita*. A concentração de DNA na amostra pode ser obtida pelo seguinte cálculo: Concentração de DNA = leitura da DO260nm x 50 x fator de diluição (usado na leitura). *50 g/ml tem DO de 1 a 260 nm DNA fita simples: 37 g RNA fita simples 40 g

7 Determinação da concentração do DNA extraído através de gel de agarose O DNA pode ser quantificado e analisado quanto à sua qualidade, por meio da análise em gel de agarose ( gel de agarose entre 0,8% e 1% ) Com as amostras de DNA, é aplicada também uma amostra cuja concentração é conhecida. O DNA do bacteriófago Lambda ( ) em concentrações conhecidas de 20, 50, 100 e 200 ng/mL é geralmente utilizado. Após a eletroforese, o gel é corado com brometo de etídio, visualizado em luz ultravioleta. As amostras são comparadas aos padrões, determinando-se dessa maneira as concentrações aproximadas de DNA em cada amostra.

8 Extração de DNA observado em gel de agarose 1% Amostras de DNA extraídas de swab oral utilizando NaCl (colunas 1–11) ou kit comercial (12–17) em gel de agarose 1%. Observar presença de maior concentração de massa em torno de pb em ambos os métodos.

9 Gel de agarose 1% com 3 l de DNA genômico M M - Marcador 1, 2 e 3 - amostras de DNA genômico

10 Estimativa do grau de pureza A relação entre a quantidade de DNA e de proteína é usada como parâmetro para avaliação da qualidade do DNA extraído grau de pureza = OD 260nm /OD280nm Razão = 1,7 – 2,0 Amostras cujos valores são acima de 2,0 muito RNA; Amostras cujos valores são abaixo de 1,8 contaminação com proteína O DNA pode ser quantificado e analisado quanto à sua qualidade, por meio da análise em gel de agarose: entre 0,8% e 1%.


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