A apresentação está carregando. Por favor, espere

A apresentação está carregando. Por favor, espere

Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) Greice Andreotti De Molfetta, PhD.

Apresentações semelhantes


Apresentação em tema: "Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) Greice Andreotti De Molfetta, PhD."— Transcrição da apresentação:

1 Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) Greice Andreotti De Molfetta, PhD

2 SAGE Vantagens: Sistema aberto – todos os transcritos podem ser identificados; Acuracia na detecção dos transcritos; Banco de dados digital; Informação quantitativa e qualitativa; Desvantagens: Caracterização de novos transcritos é computacionalmente complicada a partir de sequencias pequenas (tags); Especificidade da Tag (aumentou para 21 bp); Existência de transcritos que não contem o sítio da enzima NlaIII; Sensitividade baixa da detecçao de variantes de splicing alternativo;

3 TAGS TAGS ou ETIQUETAS: Seqüências pequenas mas exclusivas de um determinado gene. NÃO SE REPETEM EM OUTROS GENES AAAAAAAAA CATG AAAAAAAAA 10 pares de bases Banco de dados grande e validado

4 TAGS TAGS de 10 pb - identificam unicamente um transcrito; TAGS ligados uns aos outros facilitam clonagem e seqüenciamento de todos os transcritos da amostra; Análise: os tags são separados e identificados através de seus sítios de reconhecimento CATG; Velculescu et al, 1995

5 SAGE e Tags Baseando-se na existência das tags e na sua identificação: Análise em série ( Grande escala): Análise em série ( Grande escala): Identificação de um número maior de genes Identificação de um número maior de genes Transcriptoma completo de um organismo Transcriptoma completo de um organismo Custo e tempo menores Custo e tempo menores Quantificação da expressão gênica (contagem dos tags) Quantificação da expressão gênica (contagem dos tags)

6 DITAGS Localizado entre as sequências CATG Ditags apresentam pb entre cada sequencia CATG Descartar os ditags duplicados - incluindo aqueles da fita reversa da PCR Descartar as sequênicas linker Contabilizar a ocorrencia de cada tag

7 Como é um resultado de SAGE?

8 SAGE 1- Obtenção do RNAm (poli-A); 2- Síntese do cDNA com o uso de oligo (dt) biotinilado; 3- Ligação do cDNA (cauda poliA) à partículas magnéticas revestidas com Streptavidina; 4- Clivagem com uma enzima de ancoragem (NlaIII) que reconheça 4 pb (CATG); 5- Ligação de adaptadores (contendo um sítio de reconhecimento para a enzima de etiquetagem, e sítios para os primers A e B) aos cDNAs; 6- Clivagem com a enzima de etiquetagem (TE) (BsmF1), uma enzima do tipo 2 que reconhece o sítio do Adaptador (adjacente ao cDNA) clivando aproximadamente 14 pares de bases adiante, liberando um tag específico para o cDNA; 7- Ligação dos tags para formação de ditags; 8- Amplificação dos ditags por PCR com os primers A e B; 9- Isolamento dos ditags utilizando a enzima de ancoragem para retirada dos adaptadores; 10- Recuperação dos ditags; 11- Formação dos concatâmeros pela ligação dos ditags; 12- Clonagem e seqüenciamento dos concatâmeros, que formam a biblioteca de SAGE.

9 SAGE Esquema da abordagem experimental adotada pela técnica de SAGE (figura obtida do protocolo original, disponível em

10 S 18 S 4 S SAGE Extração RNA :

11 Síntese da dupla fita. A) Representação esquemática da síntese da dupla fita de cDNA; B) RT-PCR: linhas 1 e 2 são amplificações com, GAPD da amostra linhagem granulocítica (1) e amostra da linhagem ertitrocitária (2); linhas 3 e 4 são amplificações com EEF1A1 da amostra linhagem granulocítica (3) e amostra da linhagem eritrocitária. SAGE

12 Digestão com a enzima Nla III. Representação esquemática da digestão em seguida da captura da região de interesse. B) PCR usando primers específicos para GAPDH (linha 2) e EEF1A1 (linha 4). Após a digestão, um sítio de ligação do primer GAPDH é perdido (linha 3), enquanto os sítios para EEF1A1 continuam intactos (linha 5). SAGE

13 Ligação do adaptador nos pools A (linhagem granulocítica) e B (linhagem eritróide). A) representação esquemática da ligação. B) PCR usando primers específicos de cada adaptador e para o gene EEF1A1. As linhas 1 e 3 correspondem ao produto de PCR com o conjunto de primers correto, DTP-1 com o pool A e DTP-2 com o pool B. As linhas 2 e 4 correspondem ao produto de PCR com o conjunto de primers trocados SAGE

14 Formação dos tags. A) representação esquemática da clivagem com BsmFI. B) Produto da amplificação para verificar a eficiência da digestão. Linhas 1 e 3, e linhas 2 e 4 representam amplificação do pool A e B antes e depois da digestão, respectivamente. SAGE

15 Ligação e expansão dos ditags. A) Representação esquemática. B) Amplificação dos ditags nas diluições 1:20 (1), 1:40 (2), 1:80 (3); controle positivo (4), controle negativo sem ligase (5) e branco (6). C) Produtos precipitados da amplificação em grande escala com a diluição 1:120. SAGE

16 Digestão e purificação dos ditags. A) Representação esquemática da digestão com NlaIII para liberação dos ditags. B) Gel de poliacrilamida com os fragmentos resultantes da digestão enzimática. O fragmento de 26 pb foi purificado para a formação dos concatâmeros. SAGE

17 Ligação dos ditags e formação dos concatâmeros. A) Representação esquemática. B) Gel de poliacrilamida com o perfil de fragmentos de concatâmeros; o marcador é utilizado para orientar no isolamento dos fragmentos a serem clonados. SAGE

18

19 Est. VermelhoNormal Est. Branco SAGE total de tags sequenciadas:

20 Genes + expressos estímulo branco


Carregar ppt "Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) Greice Andreotti De Molfetta, PhD."

Apresentações semelhantes


Anúncios Google