Genoma funcional: identificar genes diferencialmente expressos

Apresentação em tema: "Genoma funcional: identificar genes diferencialmente expressos"— Transcrição da apresentação:

1 Genoma funcional: identificar genes diferencialmente expressos
Alguns fatos que afetam a eficiência dos métodos em identificar esses genes 15 mil a 30 mil diferentes RNAs População de RNA em uma célula > moléculas de RNA Classe RNA abundantes: 1% dos genes = 50% da pop. de RNAs Classe de RNA raros: metade dos genes = 1% pop. de RNAs

2 Genoma funcional: outras metodologias
para identificar genes diferencialmente expressos Limitações microarrays: Genes pouco expressos não são detectados Difícil separação da contribuição de diferentes isoformas de um mesmo gene Outros métodos Subtração de bibliotecas PCR supressivo mRNA fingerprint cDNA-AFLP CAP Trapper

3 sistema utilizando biotina, streptavidina e partículas magnéticas
Genoma funcional: outras metodologias para identificar genes diferencialmente expressos Subtração de bibliotecas de cDNA sistema utilizando biotina, streptavidina e partículas magnéticas Tester: biblioteca de cDNA aonde estão os genes que quero fisgar meu gene (gene induzido peloetileno:: tratamento com etileno) Driver: biblioteca de cDNA aonde não estão os genes que quero fisgar meu gene (genes não induzidos pelo etileno:: tratamento sem etileno)

4

5 Genoma funcional: outras metodologias para identificar genes diferencialmente expressos
PCR supressivo

6 PCR supressivo

7 Sequência não forma est. pan em moléculas
PCR supressivo Sequência não forma est. pan em moléculas maiores, só em menores

8 SUPRESSION PCR

9 com nucleotídeos marcados
Differential RNA display AAAAAAAA Gene 1 2 dias TTTTTT Primer OligodT GCUAAAGCGA Primer decâmero randômico Reação de PCR com baixa temperatura de anelamento, com nucleotídeos marcados radioativamente AAAAAAAA Gene 2 TTTTTT Primer OligodT GCUAAAGCGA Primer decâmero randômico AAAAAAAA Gene 3 TTTTTT Primer OligodT GCUAAAGCGA Primer decâmero randômico GCUAAAGCGA TTTTTT Condição 1 Condição 2 Gel de poliacrilamida e uréia (sequenciamento) Gene mais expresso na condição 1 Gene mais expresso na condição 2 Gene somente expresso na condição 2

10 Criticismos Pouca capacidade para detectar RNA raramente expressos Banda do gel: mistura de cDNAs: 50-75% bandas = falsos positivos Artefatos: primers curtos e baixa temp. anelamento: amplificação inespecífica Limitada quantitividade: competição pelos primers por transcritos de diferentes abundâncias Primers curtos: semi-pareamento em outras regiões do mesmo gene:dif. Clones positivos podem ser o mesmo gene Fragmentos pequenos ( bp) contendo principalmente região 3’ UTR: difícil identific. Modificações do método original Primers mais longos com programa com ciclo alterado Combinação com subtração Arbitrary primed PCR (RAP-PCR): dois primes curtos: probl. Falsos positivos Integração do protocolo para PCR de longa distância no Differential display (até 2Kb- LDD-PCR)

11 Ecotipos de A.thaliana:
EcoR I+CC and Mse I+AAA). Ecotipos de A.thaliana: linhas 1 and 2.Columbia; linhas 3 and 4. Landsberg. Genótipo: Columbia, Usando primer EcoR I+AC e: Mse I primer+AA (lanes 1 and 2); Mse I primer+AAA (lanes 3 and 4). Introdução de um novo nucleotídeo Levou a amplificação de um outro subgrupo de cDNAs

12

13

14 Uso em larga escala do cDNA-AFLP
Sinchronized tobacco cells ( 12 point into S and M→G1 transition were sampled. Exhaustive cDNA-AFLP: 360 AFLP primer combinationsÇ 18,000 AFLP tags About 10% exhibited a modulated cell cycle profileÇ 1150 AFLP tags Tobacco BY2 cells were synchronised in the G1→S transition phase using Majority of these AFLP tags either match genes of unknown function or represent novel sequences.

15

16

17

18