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Marcadores Moleculares Rodrigo Rocha Latado. Marcadores fenotípicos Características do organismo - Ex. cor da pele, cor e tipo de cabelo, presença de.

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1 Marcadores Moleculares Rodrigo Rocha Latado

2 Marcadores fenotípicos Características do organismo - Ex. cor da pele, cor e tipo de cabelo, presença de pelos, etc... Marcadores bioquímicos Presença ou ausência de compostos - Ex. isoenzimas, proteínas ou de polissacarídeos específicos, etc... Marcadores moleculares Presença ou ausência de sequências de DNA ou RNA - Ex. genes ou regiões não-codificantes - alteração em uma ou mais bases nitrogenadas

3 USOS Testes de paternidade Exames genéticos - aberrações cromossômicas ou SNP´s) para Humanos, animais, plantas e microorganismos Causas forenses (criminais, patenteamento)

4 USOS Estudos de fingerprinting (impressões digitais) - Biochips de DNA Estudos básicos de genômica e proteômica Estudos ambientais (conservação de germoplasma, avaliação da diversidade genética)

5 USOS Estudos evolucionários e populacional Melhoramento animal e vegetal (seleção assistida, seleção de progenitores)

6 CLASSIFICAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES

7 Classificação por Tipo de Técnica Métodos sem uso de PCR RFLP VNTR Métodos com uso de PCR –PCR com primers arbitrários RAPD, AP-PCR, DAF; Polimorfismo de Tamanho de Fragmento Amplificado AFLP; ISSR TRAP –PCR sítio-específico CAPS, SCAR SSRs (microssatélites) TGGE, SSCP, DGGE

8 Classificação por Número de Cópias da Seqüência Alvo Seqüência de poucas cópias - codificante RFLP Seqüência com cópias repetidas VNTR SSRs (microssatélites) ISSR Seqüência com número de cópias indefinido RAPD, AP-PCR, DAF; AFLP; CAPS, SCAR TRAP

9 MARCADORES MOLECULARES PARA MELHORAMENTO DE PLANTAS

10 Sucesso no melhoramento de plantas depende da capacidade de distinguir fatores genéticos herdáveis, dos ambientais Marcadores genéticos são unidades herdáveis simples marcadores cromossoma

11 Polimorfismo de DNA é resultado do acúmulo de mutações –pontual ou inserção/deleção –macro-rearranjos: translocações, inversões, deleções Ex. magnitude mutações pontuais: Gene Opaco-2 : pares de bases 14% das bases polimorfismo 26 fenômenos de Inserção/Deleção

12 Marcadores genéticos, quando associados a características de interesse, aumentam a eficiência de seleção R cromossoma

13 População de São Paulo habitantes em domicílios Como achar alguém? E se fosse Tokyo?

14 Aplicações no Melhoramento Mapeamento genômico –Seleção Assistida por Marcadores - MAS Diversidade genética e filogenia Caracterização de germoplasma Identificação de acessos Seleção de genitores

15 Histórico de Marcadores s - ferramentas moleculares desenvolvimento de vetores de clonagem; enzimas de restrição; polimerases; ligases; Southern (1977); 2. RFLP proposto por Botstein et al. (1980) descrito para humanos 3. PCR proposto por Mullis & Faloona (1987) 4. RAPD por Rafalski et al. (1990)

16 Histórico de Marcadores 5. Microssatélites em plantas por Akkaya et al. (1992) 6. AFLP por Zabeau & Vos (1993) 7. SCAR por Paran & Michelmore (1993) 8. Cho et al. (1999) - SNPs em Arabidopsis

17 DESCRIÇÃO DOS MARCADORES MOLECULARES

18 Marcadores Moleculares RFLP RAPD, AP-PCR, DAF PCR-específico - SSR, ISSR, CAPS, SCARs AFLP SNPs

19 Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP RFLP examina diferenças no tamanho de fragmentos de restrição de DNA específicos Polimorfismo deriva de mutação pontual, inserção, deleção Utiliza-se DNA celular total Requer DNA puro, de alto peso molecular

20 Metodologia de RFLP 1. Digerir DNA em fragmentos pequenos 2. Separação dos fragmentos por gel eletroforese 3. Transferência de fragmentos de DNA para filtro Fonte: IPGRI

21 Metodologia de RFLP 4. Visualização dos fragmentos de DNA –sondas marcadas ( 32 P) ou a frio 5. Análise dos resultados –bandas analisadas para alelos e/ou presença/ausência –diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas A escolha de sonda/enzima de restrição é crucial Fonte: IPGRI

22 digestão DNA Digestão de DNA Genômico e Separação em Gel Separação em gel

23 Transferência para Membrana de Nylon ou Nitrocelulose

24 Hibridização em Nylon ou Nitrocelulose

25 Interpretação de resultados Sítio alvo para sonda Sítio de restrição Inserção Fonte: IPGRI

26 6 Kb A Herança de RFLPs 8 Kb B 6 Kb F1F1 8 Kb 6 Kb 8 Kb 6 Kb 8 Kb F2F2

27 RFLP em Cana de Açúcar Fonte: CEBMEG

28 Vantagens e Desvantagens de RFLP Reprodutível Marcadores co-dominantes Simples Trabalhoso Caro Uso de sondas radioativas* Fonte: IPGRI

29 Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD Amplifica seqüências anônimas de DNA usando primers arbitrários –10 bases com >50% G+C PCR com um único primer Método rápido para detecção de polimorfismos Marcador dominante Problemas de reprodutibilidade

30 RAPD AA Aa aa AA Aaaa

31 Interpretação de RAPDs Marcadores RAPD são anônimos Dados binários (presença x ausência) RAPD são dominantes (AA = Aa) Problemas de co-migração –mesma banda, mesmo fragmento? –uma banda, um fragmento?

32 RAPD - resumo Rápido Simples Baixo custo Sem uso de radioisótopos Marcador dominante Problemas de reprodutibilidade Problemas de interpretação Fonte: IPGRI

33 RAPD - primer OPJ04 - Bananeira 1500 pb

34 RAPD - Feijoeiro OPAM13 OPY04


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