Biotecnologia LZT 310 Antonio Figueira

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1 Biotecnologia LZT 310 Antonio Figueira
Laboratório de Melhoramento de Plantas Centro de Energia Nuclear na Agricultura Universidade de São Paulo

2 Marcadores Moleculares
Introdução e Histórico Descrição de Marcadores Comparação entre Marcadores Moleculares Classificação de Marcadores Moleculares Características do Genoma de Planta Aplicações diversidade genética mapeamento e seleção assistida

3 INTRODUÇÃO E HISTÓRICO Marcadores Moleculares

4 Genética “arte” e seleção inconsciente
da invenção da agricultura até séc. XIX 1900s - Descoberta dos princípios genéticos Melhoramento genético científico genética quantitativa e biometria (fenótipo é previsor ruim do valor genético!) Utilização de marcadores genéticos moleculares

5 Marcadores genéticos são unidades herdáveis simples
Sucesso no melhoramento depende da capacidade de distinguir fatores genéticos herdáveis dos ambientais Marcadores genéticos são unidades herdáveis simples marcadores cromossoma

6 Polimorfismo de DNA resulta acúmulo de mutações
pontual ou inserção/deleção macro-rearranjos: translocações, inversões, deleções

7 Origem do Polimorfismo Molecular
1. Mutações pontuais - SNPs A. ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA TAGAGCACTAAGGGATCAGCAT ex. Sítio EcoRI B. ATCTCGTGATTATAGTCGTA TAGAGCACTAATATCAGCAT 2. Pequenas deleções e/ou inserções - InDels A. ATCTCGTCTAGTCGTA TAGAGCAGATCAGCAT B. ATCTCGT---GTCGTA TAGAGCA---CAGCAT

8 Marcadores genéticos quando associados a características de interesse aumentam a eficiência de seleção Função da ligação, pleiotropia e ambiente R cromossomo

9 Mapa de Piracicba “Marcadores” ???

10 População de São Paulo 9.291.000 habitantes em 2.600.00 domicílios
Como achar alguém? E se fosse Tokyo?

11 Histórico de Marcadores
1. Karl Sax (1923): propôs método para localização de QTLs ligação entre genes de característica qualitativa (cor de semente) e quantitativa (peso de semente); Problema: ausência de mutações múltiplas em estoque de elite, baixa viabilidade 2. Hunter & Markert (1957) - marcas bioquímicas desenvolveram isoenzimas em gel de amido

12 Histórico de Marcadores
3. Hubby & Lewotin (1966) demonstraram que 30% de loci de isoenzimas exibiam polimorfismo em populações selvagens de Drosophila; ’s - ferramentas moleculares desenvolvimento de vetores de clonagem; enzimas de restrição; polimerases; ligases; Southern (1977);

13 Histórico de Marcadores
5. RFLP proposto por Botstein et al. (1980) descrito para humanos 6. PCR proposto por Mullis & Faloona (1987) 7. VNTR por Jeffrey (1987) 8. RAPD por Rafalski et al. (1990)

14 Histórico de Marcadores
9. SSR em plantas por Akkaya et al. (1992) 10. AFLP por Zabeau & Vos (1993) 11. CAPS por Konieczny & Ausubel (1993) 12. SCAR por Paran & Michelmore (1993) 13. Cho et al. (1999) - SNPs em Arabidopsis

15 DESCRIÇÃO DOS MARCADORES MOLECULARES

16 Marcadores Moleculares
RFLP VNTR (minissatélite) RAPD, AP-PCR, DAF PCR-específico - SSR, ISSR, CAPS, SCARs AFLP SNPs

17 Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP
RFLP examina diferença em tamanho de fragmentos de restrição de DNA específicos Polimorfismo deriva de mutação pontual, inserção, deleção Utiliza-se DNA celular total Requer DNA puro de alto peso molecular

18 Metodologia de RFLP 1 . Digerir DNA em fragmentos pequenos
2. Separação dos fragmentos por gel eletroforese 3. Transferência de fragmentos de DNA para filtro Fonte: IPGRI

19 Metodologia de RFLP 4. Visualização dos fragmentos de DNA
sondas marcadas (32P) ou a frio 5. Análise dos resultados bandas analisadas para alelos e/ou presença/ausência diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas A escolha de sonda/enzima de restrição é crucial Fonte: IPGRI

20 Digestão de DNA Genômico e Separação em Gel
2 5 digestão 4 3 DNA 1 Separação em gel 1 2 3 4 5

21 Transferência para Membrana de Nylon ou Nitrocelulose
2 3 5 1 4

22 Hibridização em Nylon ou Nitrocelulose

23 Construção de biblioteca genômica ou de cDNA
mRNA ou DNA Clone cDNA Biblioteca de cDNA

24 Eletroforese

25 Hibridização com sonda marcada Exposição em filme de Raios-X

26 Interpretação de resultados
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 Sítio alvo para sonda Sítio de restrição Inserção Fonte: IPGRI

27 RFLP em Cana de Açúcar Sorgo Cana

28 Hibridização com sonda de sorgo
P1 P2 1:1 3:1 Hibridização com sonda de sorgo

29 Hibridização com sonda de Cana
1:1 3:1 Hibridização com sonda de Cana

30 Herança de RFLPs A B F1 F2 8 Kb 6 Kb 8 Kb 6 Kb 8 Kb 8 Kb 8 Kb 6 Kb

31 Análise de Diversidade e Filogenia por RFLP
13 5 6 2 8 A B C 13 11 A B C 9 8 6 5 4 2

32 RFLP: sondas de locos único
DNA Nuclear biblioteca genômica biblioteca de cDNA DNA Citoplasmático biblioteca de DNA cloroplástico e mitocondrial Sondas de RFLP são: locos-específica, co-dominante espécie-específica

33 RFLP: sondas multi-locus
Repetições em linha (tandem) - útil encontrada em vários loci altamente polimórficas Sequência de Minissatélite VNTR: variable number of tandem repeats uso em “DNA fingerprinting” uso de seqüências repetidas de fago M13

34 Interpretação dos resultados
A1A1 A1A2 A2A3 A1 A1 A1 A2 A2 A3 Repetição Sítio de Restrição Fonte: IPGRI

35 Vantagens e Desvantagens de RFLP
Reprodutível Marcadores co-dominantes Simples Trabalhoso Caro Uso de sondas radioativas* Fonte: IPGRI

36 Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD
Amplifica seqüências anônimas de DNA usando primers arbitrários 10 bases com >50% G+C PCR com um único primer Método rápido para detecção de polimorfismos Marcador dominante Problemas de reproducibilidade The random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique is a PCR based method which uses one or sometimes two short arbitrary primers (usually 8-10 bases) to amplify anonymous stretches of DNA which are then separated and visualised by gel electrophoresis. The key point about this technique is that nothing is known about the identity of the amplification products. The amplification products are however extremely useful as markers in genetic diversity studies. Other important features of the technique are: The number of fragments. Many different fragments are normally amplified using each single primer, and the technique has therefore proved a fast method for detecting polymorphisms. The majority of commercially produced primers result in 6 to 12 fragments; some primers may fail to give any amplification fragments from some material. Simplicity of the technique. RAPD analysis does not involve hybridisation/autoradiography or high technical expertise. Only tiny quantities of target DNA are required. Arbitrary primers can be purchased. Unit costs per assay are low. This has made RAPD analysis very popular. RAPD markers are dominant. Amplification either occurs at a locus or it does not, leading to scores of band presence/absence; this means that homozygotes and heterozygotes cannot be distinguished. Problems of reproducibility - RAPD does suffer from a sensitivity to changes in PCR conditions resulting in changes to some of the amplified fragments. Reproducible results can be obtained if care is taken to standardise the conditions used (Munthali et al., 1992; Lowe et al., 1996).

37 RAPD AA AA Aa aa Aa The random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique is a PCR based method which uses one or sometimes two short arbitrary primers (usually 8-10 bases) to amplify anonymous stretches of DNA which are then separated and visualised by gel electrophoresis. The key point about this technique is that nothing is known about the identity of the amplification products. The amplification products are however extremely useful as markers in genetic diversity studies. Other important features of the technique are: The number of fragments. Many different fragments are normally amplified using each single primer, and the technique has therefore proved a fast method for detecting polymorphisms. The majority of commercially produced primers result in 6 to 12 fragments; some primers may fail to give any amplification fragments from some material. Simplicity of the technique. RAPD analysis does not involve hybridisation/autoradiography or high technical expertise. Only tiny quantities of target DNA are required. Arbitrary primers can be purchased. Unit costs per assay are low. This has made RAPD analysis very popular. RAPD markers are dominant. Amplification either occurs at a locus or it does not, leading to scores of band presence/absence; this means that homozygotes and heterozygotes cannot be distinguished. Problems of reproducibility - RAPD does suffer from a sensitivity to changes in PCR conditions resulting in changes to some of the amplified fragments. Reproducible results can be obtained if care is taken to standardise the conditions used (Munthali et al., 1992; Lowe et al., 1996). aa

38 Interpretação de RAPDs
Marcadores RAPD são anônimos Dados binários (presença x ausência) RAPD são dominantes (AA = Aa) Problemas de co-migração mesma banda, mesmo fragmento? uma banda, um fragmento? Questionamento para filogenia banda homólogas?

39 PCR com primers arbitrários: acúmulo de siglas!
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA DAF DNA Amplification Fingerprinting AP-PCR Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction MAAP Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (sugerido por incluir todas as pequenas variações na técnica) All of the following techniques use one or two, short, GC-rich primers of arbitrary sequence. RAPD was the first to become available (Williams et al., 1990) and is by far the most commonly used of these techniques. DAF - DNA amplication fingerprinting Differences between DAF (Caetano-Anolles, et al., 1991a,b) and RAPD: higher primer concentrations in DAF shorter primers used in DAF (5-8 nucleotides) two-temperature cycle in DAF compared to 3-temperature cycle in RAPD DAF usually produces very complex banding patterns AP-PCR - arbitrarily primed polymerase chain reaction Differences between AP-PCR (Welsh and McClelland, 1990) and RAPD: in AP-PCR the amplification is in three parts each with its own stringency and concentrations of constituents high primer concentrations are used in the first PCR cycles primers of variable length, and often designed for other purposes are arbitrarily chosen for use (e.g. M13 universal sequencing primer) MAAP is only an acronym proposed by Caetano-Anolles et al. (1992) to encompass all of these closely related techniques, but which is not commonly used. Fonte: IPGRI

40 Diferenças entre ensaios com primers arbitrários
RAPD 10mers, gel de agarose corado com brometo DAF 5mers, gel de acrilamida e reação marcada 32P AP-PCR 10mers, gel de acrilamida e reação marcada 32P All of the following techniques use one or two, short, GC-rich primers of arbitrary sequence. RAPD was the first to become available (Williams et al., 1990) and is by far the most commonly used of these techniques. DAF - DNA amplication fingerprinting Differences between DAF (Caetano-Anolles, et al., 1991a,b) and RAPD: higher primer concentrations in DAF shorter primers used in DAF (5-8 nucleotides) two-temperature cycle in DAF compared to 3-temperature cycle in RAPD DAF usually produces very complex banding patterns AP-PCR - arbitrarily primed polymerase chain reaction Differences between AP-PCR (Welsh and McClelland, 1990) and RAPD: in AP-PCR the amplification is in three parts each with its own stringency and concentrations of constituents high primer concentrations are used in the first PCR cycles primers of variable length, and often designed for other purposes are arbitrarily chosen for use (e.g. M13 universal sequencing primer) MAAP is only an acronym proposed by Caetano-Anolles et al. (1992) to encompass all of these closely related techniques, but which is not commonly used.

41 RAPD - resumo Rápido Simples Baixo custo Sem uso de radio-isótopos
Marcador dominante Problemas de reproducibilidade Problemas de interpretação Fonte: IPGRI

42 RAPD - primer OPJ04 - Bananeira
1500 pb

43 RAPD - Feijoeiro OPY04 OPAM13

44 Sítio de Seqüência Dirigida (Sequence-tagged sites)
Sequence-Tagged Microssatélites (STMS) ou SSR ou Microssatélites Microssatélites ancorados Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) Sequence-characterized amplified regions (SCARs) Cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) More and more sequence information is becoming available from different sources and can be located in widely available databases. This information is extremely useful for developing new strategies for the analysis of genetic variation. A sequence-tagged site (STS) is the general term given to a marker which is defined by its primer sequences (Olsen et al., 1989). STSs have been used extensively for mapping of the human genome. Examples of STSs are given in the following slides, namely: Sequence-tagged microsatellites (STMS) also known as Simple Sequence Repeat Polymorphisms (SSRP) Anchored microsatellite oligonucleotides including inter-simple sequence repeat (ISSR) primers Sequence-characterised amplified regions (SCARs) Cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) Fonte: IPGRI

45 Microssatélites (SSR)
Sequence-Tagged Microsatélites (STMS) também conhecido como microssatélite ou Simple Sequence Repeat (SSR) Normalmente locus simples e multi-alélico Co-dominante Altamente reprodutível

46 Microssatélites STMS ou SSRs
Seqüências curtas (1 a 6 bases) repetidas em tandem Presentes em procariotos e eucariotos Presentes em regiões codificantes e não codificantes Maioria das repetições são dinucleotídeos (AC) n (AG) n (AT)n

47 Microssatélites Polimorfismo devido a diferenças no número de repetições Escorregamento da DNA polimerase durante a replicação Crossing-over desigual entre cromátides irmãs Codominantes Normalmente locos simples e multi-alélico

48 Microssatélites (SSR)
altamente informativo - vários alelos por locos detecção por PCR facilmente transferível entre labs distribuição homogênea no genoma

49 Microssatélites (SSR)
Primer FOR NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN Repetição CA Primer REV

50 Microssatélites (SSR)
Obtenção de seqüências: a partir de banco de dados de genoma ou cDNA hibridação com biblioteca genômica, identificação de clones e seqüenciamento construção de biblioteca enriquecida por afinidade com seqüência da matriz

51 Microssatélites Detecção do polimorfismo Géis de agarose
Géis de acrilamida (detecta diferenças de até 2pb) coloração direta: nitrato de prata (barato) Coloração indireta: marcação radioativa ou fluorescente

52 Microssatélites Problemas
Custo e trabalho envolvidos no desenvolvimento dos primers Construção de bibliotecas genômica sequenciamento Triagem dos melhores primers Possibilidade de se usar seqüências depositadas em banco de dados

53 Microssatélites (SSR)
Primer FOR NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN Repetição CA Primer REV

54 Enriquecimento e Seleção Amplificação após enriquecimento
Digestão DNA genômico total Seqüência microssatélite Ligação Adaptadores Nicotiana tabacum Adaptadores Amplificação ssDNA Sonda biotinilada Enriquecimento e Seleção ssDNA Coluna Bolinha magnética-estratividina Amplificação após enriquecimento

55 Enriquecimento e Seleção
95°C / 15 min ssDNA Sonda biotinilada Biotina IIIII(CT)8 ou Biotina IIIII(GT)8 Temperatura ambiente / 20 min água Coluna Magnética

56 Amplificação após enriquecimento
Digestão com RsaI Amplificação após enriquecimento Dna Total Amplificação Nicotiana ripanda N. sylvestris N. tabacum “Coker 176” N. tabacum “Ky 14 RMI” Ligação com adaptadores

57 Transformação e Seleção Transferência e Southern blot
Clonagem Transformação e Seleção Vetor Meio LB + amp + X-gal + IPTG PCR Transferência e Southern blot Sequenciamento Desenho de primers

58 Até 24/02/05 Todas as placas foram testadas
N. tabacum “Coker 176” N. sylvestris

59 Microssatélites (SSR)
Southern blot - clones SSR’s positivos 32P Amplificação insertos clonados

60 Microssatélites (SSR)
(AG)14 (TC)15

61 (AG)30 >ZZFIGCO001g_A04_.g_033_Rome.ab1 CHROMAT_FILE:
CGATTGGGCCGACGTCCATGCTCCGGNNCGCATGTCGGCCGCGGGAATTCGATTCTCTTGCTTACGCGTGGACTAGCTTACAATAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTTTTGGCTGATGCCTTATCTCAAAAGAAGAAACGACCCTATATATAGAAAAGAAAAAAACAGAAAGAATCTATGCACAGTAAAGTAGGTCCCATATGTGGGTCCCTTATACAGTGTATTTACTGTGTATACAATATTTCTACTATATAAACAATGTATCTACTGTTGAGTGGGTCGGCGGCCTCACTGTTGATCATATTCCACGTCTCTCTAATTCTTTCATCTGTTGGATGAAATCTTCCGCATTTTCTACAGCTTCGTCAGATAATATCTTCTCCGATTGAATAGGCTGAGAATCTTCTGCAATATCATCGTTGCTTGTTTCACTTCGCATTAAAGTGTCAGATTTTTCATACTGGTTAATAGATTGAAGTAAGTTTCTTTTTACTTCTTCCAAATACTTATTAATCAATTTCTATAAGATAAACATATAAGTTCAGATCCAGGCACATAATTATAACCATGCGTTTTCACACGTATTTGTCAAAATAAGTCTGCATTTCTCACTTCTTTTTCCTGGTTAAGACCCGTTATACCCTCCAATTATACTTGGAACACCTTTTATCGGCGCTATTTATCCTTTTACTAGCATAGATTCTAAAGGATTTACCACAACTTATAAAAATAAAAGAATAGGTTATACCTTTGTTACCGATCCCGTAACTAGGGGATATAATGGCTTTATTAGATATAAATCCAAAATATATT (AG)30

62 Microssatélites Bananeira 3x e 4x Cir 24.25

63 Microssatélites Seta: alelos genoma B

64 Microssatélites Ancorados ISSR
Amplificação de segmentos genômicos flanqueados por repetições Anelamento locos-específico Inter-simple sequence repeats (ISSR) ancorados na extremidade 3’ ou 5’ Marcadores dominantes Microssatélites mais úteis que minissatélites

65 Microssatélites Ancorados ISSR
NNNNN (CA) n (CA) n NN NNNNNNNNN CACACACACACACAC NNNNNNNNNNNN CACACACACACACAC NNNNN NNNNNNNNNGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTG NNNNN Repetição CA (CA) n NN NNNNN (CA) n ISSR 5’ ou 3’ancorado

66 Nanicão Jangada Control
ISSR UBC UBC 816 Variante Anão Nanicão Jangada Control N A

67 SCARs SCARs - sequence-characterised amplified regions
proposto por Paran & Michelmore (1993) marcador locus-único derivado de fragmentos sequenciados de RAPD, ISSR, AFLP maior estabilidade - primers específicos analisado para presença/ausência possibilidade de simplificação de análise e automação

68 SCARs R S * clonar Primer específico Seqüenciar

69 SCAR - Feijoeiro ROC20460

70 CAPS ou PCR-RFLP CAPS - cleaved amplified polymorphic sequence
marcador locus-específico produto amplificado por PCR e analisado por RFLP seqüência de banco de dados, clones de cDNA ou genômico codominante

71 CAPS Locus Seqüenciado - primers específicos Enzimas de Restrição
AluI HaeIII MboI PCR específico A B A B A B A B locus 1 Digestão com Enzimas Corte freqüente 2

72 CAPS - Feijoeiro

73 CAPS - Feijoeiro

74 Amplified Fragment Length Polymorphism - AFLP
Combinação de RFLP e PCR Resulta em padrões muito informativos Marcador dominante Método cada vez mais usado

75 digestão com duas enzimas EcoRI
MseI DNA genômico digestão com duas enzimas EcoRI adaptadores MseI EcoRI ligação pré-amplificação amplificação seletiva

76 DNA digestão ligação pré- amplificação primer +1 amplificação
GAATTCCN NTTAA CTTAAGCN NAATT digestão ATTCCN NT MseI EcoRI GCN NAAT ATTCCN NT TA ligação TAA GCN N AT A pré- amplificação primer +1 ATTCCN NTTA TAAGCN NAAT C AAC amplificação primer +3 ATTCCA GTTA TAAGCT CAAT AAC

77

78 AFLP de cana com 33P

79 AFLP de feijão gel desnaturante corado com prata

80 COMPARAÇÃO ENTRE MARCADORES MOLECULARES

81 Marcadores derivados de Retrotransposons

82 Escolha de Marcadores Característica RFLP RAPD SSR AFLP ISSR CAPS
Polimorfismo Pontual Pontual # Pontual Pontual Pontual InDel InDel Rep. InDel InDel InDel Nível de Polimorfismo médio médio alto médio médio baixo Abundância alta m.alta média m.alta média alta Dominância CoDom Dom CoDom Dom Dom CoDom [DNA] mg ng 50 ng ng ng ng Seqüência não não sim não não sim Marcação sim/não não não sim/não não não Repetibilidade alta baixa alta média baixa alta

83 CLASSIFICAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES

84 Classificação por Tipo de Técnica
Métodos sem uso de PCR RFLP VNTR Métodos com uso de PCR PCR com primers arbitrários RAPD, AP-PCR, DAF, MAAP; Polimorfismo de Tamanho de Fragmento Amplificado AFLP; ISSR PCR sítio-específico CAPS, SCAR SSRs (microssatélites) TGGE, SSCP, DGGE

85 Classificação por Número de Cópias da Seqüência Alvo
Seqüência de poucas cópias - codificante RFLP Seqüência com cópias repetidas VNTR SSRs (microssatélites) ISSR Seqüência com número de cópias indefinido RAPD, AP-PCR, DAF, MAAP; AFLP; CAPS, SCAR

86 Zucchi, M. 2004

87 Zucchi, M. 2004

88 Arabidopsis – Single Nucleotide Polymorphism
comparação de seqüência entre 82 Mb de Columbia x 92,1 Mb Landsberg SNPs: (1 SNP por 3,3 kbp) exon = 3,1 kb intron = 2,2 kb intergênico = 3,5 kb InDels: (1 InDel por 6,1 kbp) 98% < 50 pb SNPs/ Indels AGI et al Nature 408:796

89 arroz indica x japonica
Nipponbare GLA (japonica) (indica) ,8 Mb ,9 Mb SNPs em seqüência repetida (%) 0, ,65 InDels em seqüência repetida (%) 0, ,27 SNPs em seqüência única (%) 0, ,50 InDels em seqüência única(%) 0, ,15 Fração de seqüência repetida (%) 24, ,8 Fração de seqüência única (%) 74, ,1 Parte não alinháveis por BLAST (%) , ,1 Diferenças em nt arroz indica x japonica Yu et al Science 296:79

90 Milho seqüências de 21 locos cromossomo 1
16 landraces exóticas + 9 linhas média: 1 SNPs por 28 pb entre dois genótipos: 1 SNP por 104 pb InDels: 24% de 14,42 kb Milho = 1,4 X mais variável do que Drosophila = 11 X mais variável do que humanos Tenaillon et al PNAS 98:9161

91 APLICAÇÕES DOS MARCADORES MOLECULARES

92 Aplicações no Melhoramento
Diversidade genética e filogenia Conservação e caracterização de germoplasma Identificação de acessos Seleção de genitores Filogenia Mapeamento genômico Seleção Assistida por Marcadores - MAS Clonagem de genes por caminhamento

93 Zucchi, M. 2004

94 Diversidade genética Marcadores Multialélicos
locos de RFLP = região hibridizada com sonda endonuclease: sítios de restrição interno na sonda locos parálogos = família de genes Microssatélites = loco definido pelos primers duplicação de locos Marcadores Binários -> presença x ausência RADP, AFLP, ISSR: cada banda, um loco sem definição de homologia, apenas no primer

95 Zucchi, M. 2004

96 Zucchi, M. 2004

97 Zucchi, M. 2004

98 Zucchi, M. 2004

99 Zucchi, M. 2004

100 Zucchi, M. 2004

101 Zucchi, M. 2004

102 Zucchi, M. 2004

103 Diversidade genética Marcadores Multialélicos - RFLP e SSR
parâmetros de genética de populações % de locos polimórficos, # médio de alelos/locos; índice de diversidade de Nei, etc. Marcadores Binários - RADP e AFLP número de alelos = 2 (presença x ausência) frequência alélica: depende equilíbrio HW ou homozigoze total utiliza-se similaridade genética

104 Análise de Relações Genéticas Marcadores Binários
Vários índices de similaridade Nei & Li, Dice, Jaccard, Simples Métodos Fenéticos: similaridade entre amostras -> análise de agrupamento (cluster) dendrograma por UPGMA, Neighbor-Join -> análise de Coordenadas Principais mutlidimensional (2D ou 3D) Programas: NtSys-Pc (Exeter Software) WinBoot - análise de bootsrap

105 Análise de Relações Genéticas Marcadores Binários
Dissimilaridade = (1 – Similaridade) Baseada em dados binários (presença x ausência) portanto marcadores dominantes Distância Genética = utiliza freqüências alélicas – marcadores co-dominantes Utiliza conceito genéticos e/ou geométricos

106 Zucchi, M. 2004

107 Análise de Relações Genéticas Marcadores Binários
número de alelos = 2 (presença x ausência) utiliza-se similaridade genética Construção de matriz amostra x estado marcador A B C Construção de matriz de similaridade A B C A B 0,88 1, C 0,66 0,5 1,0

108 Diversidade genética Frequência alélica permite estimar medidas de diversidade genética e estrutura genética de populações % de locos polimórficos, # médio de alelos/locos; índice de diversidade de Nei, Estatísticas F de Wright, etc. Programas: PAUP, TFPGA, PHYLLIP, Genetix

109 Marcadores no Mapeamento Genético

110 Mapeamento Genético Mapa genômico define arranjo dos vários locos
Representação gráfica de cromossomos Distância entre locos definida por recombinação cMorgans -taxa de recombinação

111 Drosophila – mapa genético com marcas morfológicas

112 Aplicações do Mapeamento Genético
Mapas genéticos possibilitam: Cobertura e análise completa do genoma Decomposição de características genéticas complexas nos seus componentes mendelianos Localização de regiões genômicas que controlam características de importância econômica Quantificação do efeito destas regiões sobre a característica

113 Mapeamento Genético Requisitos Básicos:
Reprodução sexuada e produção de descendentes Marcadores devem apresentar segregação Mendeliana na progênie avaliada Produzir gerações em desequilíbrio de ligação para os locos segregantes, permitindo a análise da ligação

114 Mapeamento Genético Desequilíbrio de ligação
desvio das freqüências alélicas observadas em relação às freqüências esperadas sob a hipótese da segregação independente, sugerindo uma associação entre locos

115 Mapeamento Genético  2 (fo – fe)2 = fe
Associação entre dois locos localizados num mesmo cromossomo, para os quais as proporções genotípicas esperadas após um determinado cruzamento se afastam das proporções mendelianas Teste: 2  (fo – fe)2 fe =

116 Principais delineamentos
Seleção de população a ser mapeada genitores de elite x exótico F2 BC1 linhas recombinantes endógenas (RI) (>F8) haplóides duplicados F1 - pseudo-testcross

117 Principais delineamentos
Populações F2 F1 AB Ab aB ab Genitor A x Genitor B AB/AB ab/ab AB/ab F2 F1 AB Ab aB ab AB/AB ab/Ab AB/aB AB/ab Ab/AB Ab/Ab Ab/aB Ab/ab aB/AB aB/Ab aB/aB aB/ab Ab/AB ab/Ab ab/aB ab/ab 

118 Populações F2 Ex. Marcador RFLP Segregação 1:2:1
AA aa Aa Aa Aa AA aa Aa aa AA aa Aa AA aa Aa AA Aa Segregação 1:2:1

119 Principais delineamentos
Populações obtidas por retrocruzamentos (backcross) Parental A x Parental B AB/AB ab/ab F1 x Parental B AB/ab ab/ab F1 AB Ab aB ab AB/ab Ab/ab aB/ab ab

120 Populações obtidas por retrocruzamento
Ex. Marcador RFLP AA aa Aa AA AA AA Aa Aa Aa AA Aa AA AA Aa Aa Aa Aa Segregação 1:1

121 Principais delineamentos
Pseudo-testcross usado para espécies heterozigotas (fruteiras e florestais) e espécies poliplóides Gerações F1 semelhante a geração F2 Usado com marcadores dominantes P1 = Aa bb Cc dd x P2 = aa Bb cc Dd Aa:aa bb:Bb Cc:cc dd:Dd Segregação 1:1 presença/ausência

122 Construindo um mapa de locos de herança simples

123 Ex. marcador RFLP

124 Genótipos parentais para os locos A e B
Parental 1 = AA BB Parental 2 = aa bb Marcadores para cada loco (A e B) segregam mendelianamente? Loco A: 50% AA, 50% aa Loco B: 50% BB, 50% bb Teste 2 Aa Bb F1 dihaplóides

125 Ex. marcador RFLP

126 Genótipos parentais para os locos A e B
gametas Parental 1 = AA BB Parental 2 = aa bb Genótipos segregam mendelianamente para os locos A e B conjuntamente? Delineamento dihaplóide – genótipos AABB, aabb, AAbb, aaBB (1:1:1:1) Se não ligados Ab + aB = 50% Aa Bb F1 AB ab Ab aB

127 Ex. marcador RFLP

128 A proporção dos genótipos observados difere do esperado?
2 (fo – fe)2 fe =  (O) (E) (O – E)2 (O – E)2/E AABB 6 3,75 5,06 1,3 aabb 7 10,56 2,8 aaBB 1 7,56 2,0 AAbb 2 = 8,1* (P) (R) Gl = 3

129 Freqüência de recombinantes (c)
total cAB = 2/15 = 0,133 c = B A 13,3 cM

130 Para um terceiro loco (C)
Parental 1 = AA CC Parental 2 = aa cc F1 AaCc (P) AA CC 6 (P) aa cc 6 (R) AA cc 2 (R) aa CC 1 cAC = 3/15 cAC = 0,2 C A B 13,3 6,7 20 cM

131 Freqüências de recombinação entre dois locos não são aditivas!
Interferência: ocorrência de um crossing reduz a probabilidade de outro crossing em regiões adjacentes CAC = CAB + CBC – 2CABCBC CAC = 0, ,067 – 2(0,133)(0,067) CAC = 0,182 C A B 13,3 6,7 18,2 cM

132 Funções de mapeamento Propriedades
corrigem distâncias calculadas em cM para porcentagem de recombinantes (c) 1 cM = 1% recombinação Propriedades Distâncias entre os locos aditivas (AC = AB + BC) Distâncias > 50 cM: fração recombinação 50% (locos não ligados)

133 Funções de Mapeamento Função de Haldane (1919) Propriedades
Permutas ocorrem ao acaso ao longo do cromossomo Ocorrência de permutas independentes, sem interferência d = - ½ ln (1 – 2c)

134 Funções de Mapeamento Função de Kosambi (1954) Propriedades
Interferência completa entre regiões muito próximas, interferência menor locos mais distantes e I = 0 para locos independentes. d = ¼ ln [ (1 + 2c) (1 – 2c)]

135 Programas computacionais para mapeamento
Linkage 1 (Suiter et al., 1983) MapMaker (Lander et al. 1987) GMendel (Liu & Knapp, 1992) JoinMap (Stam, 1993) QTL Cartographer (Basten et al., 1999)

136

137 Mapa genético de Musa acuminata, obtidos a partir de 373 marcadores
Mapa publicado (Fauré et al., 1993). Progênies de SFB5, M53 e SF265 autofecundado Mapa genético de Musa acuminata, obtidos a partir de 373 marcadores (isoenzimas, RAPD, RFLPs, AFLP e SSR).

138 GL 7 transgene Cor do fruto

139 Mapeamento de Caracteres quantitativos
Características Quantitativas: Segregação de grande número de genes para o caráter Cada gene contribui com pequeno efeito para o valor fenotípico total Genes apresentam ações gênicas aditiva, dominante e sobredominante A expressão do fenótipo é altamente influenciada pelo ambiente Os dados apresentam distribuição normal Pode-se caracterizar o tipo de ação gênica comparando-se as médias fenotípicas das gerações segregantes com as médias parentais

140 Mapeamento de Caracteres quantitativos
QTL: genes ou locos cromossômicos que controlam uma determinada característica quantitativa Exemplos: produção, teor de sacarose, altura da planta, rendimento de madeira, ciclo, peso Marcadores moleculares possibilitam identificar, mapear e medir a magnitude do efeito dos principais fatores genéticos envolvidos no controle do caráter

141 Mapeamento de Caracteres quantitativos
A capacidade de se detectar um QTL depende: Magnitude se seu efeito sobre o caráter Tamanho da população segregante Freqüência de recombinação entre o marcador e o QTL Herdabilidade da característica

142 Mapeamento de Caracteres quantitativos
Uso do Mapeamento genético Identificação de QTLs Seleção assistida Clonagem por posicionamento

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