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Quantificação de RNA PCR quantitativo (RT-PCR Tempo Real)

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Apresentação em tema: "Quantificação de RNA PCR quantitativo (RT-PCR Tempo Real)"— Transcrição da apresentação:

1 Quantificação de RNA PCR quantitativo (RT-PCR Tempo Real)

2

3 Métodos de Detecção de RNA Northern Blots Hibridização in situ Teste de Proteção de RNAse RT-PCR (qPCR) Microarranjo

4 qPCR Rapidez Sensibilidade Especificidade

5 PCR Eletroforese Confirmação do produto específico PCR Caixa Preta

6 PCR em tempo Real

7 PCR Tempo Real Amplificação Visualização da amplificação em tempo Real Curva de Melting

8 Etapas RNA RT PCR Quantificação Iniciadores e/ou sondas Modelos matemáticos

9 Desnaturação inicial (95 o C – 5) Desnaturação (95 o C – 15 a 1) Anelamento (50 a 65 o C – 1) Extensão (72 o C – 1) Extensão final (72 o C – 10) Resfriamento (4-10 o C - ) x Fases da PCR

10 Equipamentos RotorGene 3000 (Corbett) LightCycler (Roche) iCycler iQ (BioRad) ABI Prism 7700

11 Detecção do sinal Fluoróforos –Associados a sondas –Intercalados ao produto amplificado

12 Beacons

13 TaqMan

14 Scorpion

15 Syber Green I

16 Desenho do Fragmento Menor que 100 pb –Amplificam com maior eficiência –Denaturam com maior facilidade –Eficiência da Taq ( pb/sec) Menor fragmento 67 pb

17 Desenho dos Iniciadores Separando Exons Programas Tamanho – pb –5 GC entre 20-70% –Tm o C

18 Quantificação Absoluta –Número de cópias por amostras –Curva padrão Relativa –Amostra A tem mais copias que B –Normalização (Gene Referência)

19 Quantificação - Conceitos Visualização da amplificação em tempo Real Threshold Ct

20 Quantificação - Absoluta Curva Padrão

21 Quantificação - Relativa Controle. Tratamento Gene Alvo Gene Ref Gene Alvo Gene Ref Modelos Matemáticos DELTA

22 Gene Referência Gene Alvo Controle Tratamento Controle tratamento Quantificação - Relativa Pfaffl (2001)

23 Armadilhas Qualidade do RNA Especificidade x Inespecificidade da sonda Linearidade da RT Analise do dados O threshold

24 Conclusões Rapidez Sensibilidade Especificidade Limitado pelo alto custo dos reagentes e equipamentos


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