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2/18/2014 Químicas e Aplicações OPTICON Continuous Fluorescence Detection System.

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1 2/18/2014 Químicas e Aplicações OPTICON Continuous Fluorescence Detection System

2 Carlos Martins 2/18/2014 Principais Químicas SYBR Green 1 SYBR Green 1 Molecular Beacons Molecular Beacons TaqMan TaqMan

3 Carlos Martins 2/18/2014 Revisão Como funcionam essas químicas Em que etapa da reação o sinal é visto: Denaturação, Anelamento, Extenção Aplicações para cada química

4 Carlos Martins 2/18/2014 SYBR Green 1

5 Como funciona? Liga-se ao dsDNA SYBR Green 1 fluoresce quando na presença de dsDNA G T T T G G C C C C C C C A A A G G G A C T T G A T A G C A T C G T A A

6 G T T T T T T G G G G C C C C C C C C A A A A A T A C C GG G G T T A C G A A C G G T A A T DNA denaturado SYBR Green 1 não ligado Desnaturação: Não emite Sinal

7 G T T T T G G C C C C C C C C A A A A A A T G C A C T G Annelamento dos Primers: Fluorescência

8 SYBR Green 1 ligado ao dsDNA G T T T G G C C C C C C C A A A G G G A C T T G A T A G C A T C G T A A Extenção: Fluorescência Ponto de leitura

9 Análise Quantificação da concentração inicial do Template: SIM Análise de Curvas de Melting: SIM; verificação de produtos únicos, variantes, produtos múltiplos e/ou complexos primer dimer Análise de End Point SIM; Leitura realizada após terminada a amplificação

10 Quantificação de concentração inicial de Template Maior concentração inicial de DNA, menor número de ciclos necessário para detecção. Usa-se comparação de Controles de DNA contra amostras desconhecidas e obten-se um gráfico. Intensidade de Fluorescência Número de Ciclos Número de Ciclos 10 5 C(T) Controle Desconhecido

11 Análise de Curva de Melting Análise de Curva de Melting Identificação do produto por T m Intensidade de Fluorescência Temperatura TmTm

12 Identificação do Produto por perfil térmico, t m - T m de cada amostra difere pela concentração de GC e pelo comprimento Análise de Curva de Melting Produto de interesse Produto não específico -dI/dT Temperatura Intensidade de Fluorescência

13 Carlos Martins 2/18/2014 Fácil de usar - Não utiliza probes de difícil desenho Não é sequência-específico - Pode ser usado para diferentes templates Baixo custo Sensível Vantagens do SYBR Green 1

14 Carlos Martins 2/18/2014 Desvantagens SYBR Green 1 Ligação a produtos não-específicos Pode inibir a reação à altas concentrações – Solução: sistema mais sensível

15 Carlos Martins 2/18/2014 Molecular Beacons

16 Como funciona? Stem é composto de sequências complementares O loop é complementar a sequência alvo Probe em forma de alça (hairpin) Fluoróforo absorvido por um quencher

17 Denaturação: Fluorescência Não-específica

18 Anelamento: Fluorescência Fluoróforo Sequência alvo Loop Stem Quencher Ponto de Leitura Probe hibridizado

19 Extenção: Sem Fluorescência Probes não ligados

20 Aplicações Quantificação de Detecção de sequências específicas. Deteção de Single Nucleotide Polymorphisms -Sistemas de detecção simples requerem corrida em duplicata

21 Vantagens Alta epecificidade de detecção -Melhor técnica para detecção de SNP Pode ter custo reduzido quando utilizado para screening do mesmo Target Permite escolha do Fluoróforo

22 Desvantagens Design complicado Específico para um Target Custo elevado

23 Carlos Martins 2/18/2014 TaqMan

24 Como funciona? Probe Target-específico 5 Reporter and 3 Quencher 5 ReporterQuencher Complementar a sequência alvo

25 Denaturação: Sem Fluorescência Sem Hibiridização

26 Anelamento: Sem Fluorescência Hibridização do Probe

27 Extenção: Polimerização Não ocorre extensão do probe

28 Extensão: Strand Displacement Probe desligado no 5 Reporter pela Taq Polymerase

29 Extenção: Clivagem e Fluorescência Probe clivado via atividade exonuclease 5-3 Taq polymerase

30 Análise Curva de Melting : NÃO Não é possível análise de Curva de Melting devido as propriedades do probe Quantificação de concentração inicial de Quantify Template: SIM Análise de End point : SIM

31 Aplicações Deteção e Quantificação de amostras específicas. Deteção de Single Nucleotide Polymorphisms -Sistemas de detecção simples requerem corrida dupla

32 Vantagens Alta específicidade -Bom para detecção de SNP Design menos complicado que Molecular Beacons Custo reduzido quando utilizado para o mesmo Target Livre escolha do Fluoróforo 5

33 Desvantagens Desenhado especificamente para um target Não permite análise de Curvas de melting

34 Resumo Química Como FuncionaQuencher Detecção do SinalPrincipal aplicação SYBR Green I Liga-se a menor curva do dsDNANão Qualquer etapa Quantificação e Detecção. Análise de Curvas de Melting Molecular Beacons Probe Hibridização (Hairpin)SimAnelamento Detecção de SNP Quantificação e Detecção TaqMan Probe Hibridização (5-3 Exo)SimExtenção Detecção de SNP Quantificação e Detecção

35 Carlos Martins 2/18/2014 DNA Engine OPTICOM DNA Engine OPTICOM Real Time PCR

36 Carlos Martins 2/18/2014 Especificações: Exitação e detecção Solid state Capacidade de 96 amostras Single color Dynamic range: 7 Ordens de magnitude Upgradeable Baseado na plataforma PTC-200 Windows NT DNA Engine Opticon

37 Carlos Martins 2/18/2014 DNA Engine Opticon Melhor: Extremamente sensível <5nM Fluorescein Grande dynamic range Baseado em tecnologia já existente Não utiliza partes móveis Pequeno tamanho Upgradeable Gradiente Baixo custo: $35,000

38 Carlos Martins 2/18/2014

39 Carlos Martins 2/18/2014Technologia 96 LEDs focados em cada poço/amostra Cada Poço é exitado individualmente( nm) Detectado por PMT ( nm) Exelente para SYBR Green e FAM

40 Carlos Martins Opticon Opticon Plataforma DNA Engine Unidade Alpha 96V Torre Opticon Opticon Opticon

41 Carlos Martins Plataforma PTC 200 DNA Engine Tecnologia de Ponta Tecnologia de Ponta Referência em termocicladores Referência em termocicladores

42 Carlos Martins Unidade Alpha96V Placas ou Tubos Placas ou Tubos Tampas chatas ou filme Tampas chatas ou filme

43 Carlos Martins Torre Opticon Light Emitting Diode (LED) Array Light Emitting Diode (LED) Array Uso de Fotomultiplicador (PMT) Uso de Fotomultiplicador (PMT) Lentes Fresnel Lentes Fresnel

44 Carlos Martins LED Array

45 Carlos Martins Fotomultiplicador PMT

46 Lentes Fresnel Lentes Fresnel

47 VVVVVVVVVVVV

48 Carlos Martins 2/18/2014 Opticon Opticon Baseado em Tecnologia de ponta – PTC 200 Plataforma completa – acompanha computador Design simples – ocupa pequeno espaço Alta sensibilidade – capta < 5nM Fluorescein Manutenção com menor custo Menor preço Assistência técnica já presente no Brasil


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