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Genética Molecular em Análises Clinicas

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Apresentação em tema: "Genética Molecular em Análises Clinicas"— Transcrição da apresentação:

1 Genética Molecular em Análises Clinicas
TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Prof.Doutor José Cabeda

2 Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos
PCR Real Time PCR NASBA/TMA

3 PCR

4

5 OPTIMIZAÇÃO DO PCR [MgCl2] Th [dNTP] [primers] [DNA] [inibidores]

6 Variações RT-PCR Multiplex PCR Nested PCR

7 Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos
PCR Real Time PCR NASBA/TMA

8 Principio de funcionamento do Real-Time PCR
2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

9

10 Detecção dos produtos de PCR

11 Montar uma reacção

12 Prof.Doutor José Cabeda
Químicas Utilizáveis 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

13 SYBR-Green I Excitation 5’ 3’ SG SG SG SG SG

14 SYBR-Green I Excitation Emission SG SG 5’ 3’ SG SG SG

15 Detcção com SybGreen

16 Sybr-Green Detection Intercalates to dsDNA
Inhibits DNA amplification so concentration is critical Detects specific and non-specific targets Low starting background with large increase in signal Can run a melt curve to look at product specificity

17 Detecção com sondas

18 Quimicas utilizáveis: sondas taqman

19 Sequence specific probes: Dual labeled probes
5’ 3’ Excitation Excitation 5’ 3’ Q R R R Q Q R Q

20 Quimicas utilizáveis: molecular beacons

21 Molecular Beacons I 10mer 25mer FAM DabCyl

22 Molecular Beacons II Emission R Q Excitation R Q Q R X

23 Molecular Beacons II Emission R Q Excitation R Q Q R X

24 Molecular Beacons III Can be used to quantitation and mutation detection Need beacons for the normal and mutation sequence Design is difficult due to nature of folding structure Expensive when compared to FRET

25 Quimicas utilizáveis: sondas FRET

26 Prof.Doutor José Cabeda
Hyb-ProbesTM Emission Excitation Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: Quencher Transfer 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

27 Quenched FRET analysis
5’ 3’ Two labeled probes, FAM at the 5’ and BH1 on the 3’ When the probes hybridize the FAM energy is quenched by the BH1 After the product is amplified run a melt curve to determine genotype Different melt points are seen for normal and mutation

28 Quimicas utilizáveis: sondas Eclipse
F Q MGB Q F

29 Prof.Doutor José Cabeda
Aplicações Quantificação 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

30 End Point versus Real-Time

31 Quantificação

32 Detecção de Mutações / SNP
Aplicações Detecção de Mutações / SNP 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

33 Detecção de mutações

34 Prof.Doutor José Cabeda
Aplicações Multiplex Detection 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

35 Detecção simultânea de vários produtos

36 Prof.Doutor José Cabeda
Os equipamentos 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

37 Light Cycler

38 Smartcycler

39 Rotorgene The samples spin continually during a run at 500 rpm
The samples are heated and cooled in a low mass air oven Tubes are illuminated as they pass the detector On data acquisition energy is averaged over 20 revolutions to give the fluorescence of each sample Four Channels Ch1: ex 470nm, det 510nm Ch2: ex 530nm, det 550nm Ch3: ex 585nm, det 610nm Ch4: ex 625nm, det 660nm

40 O Futuro próximo

41 Detecção com sondas

42 Detcção com SybGreen

43 Quantificação

44 Detecção de mutações

45 Detecção simultânea de dois produtos

46 Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos
PCR Real Time PCR NASBA/TMA

47 NASBA/ NUCLISENS

48 Amplification: schematic diagram
Primer 1 Legend: sense RNA antisense RNA sense DNA antisense DNA Reverse Transcriptase RNase H Primer 2 Reverse Transcriptase T7 RNA polymerase Primer 2 Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase RNase H Primer 1

49 Técnicas de amplificação de Sinal
bDNA (Quantiplex)

50 bDNA (I)

51 bDNA (II)

52 bDNA (III)

53 bDNA (IV)

54 bDNA (V)


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