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Genética Molecular em Análises Clinicas
TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Prof.Doutor José Cabeda
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Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos
PCR Real Time PCR NASBA/TMA
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PCR
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OPTIMIZAÇÃO DO PCR [MgCl2] Th [dNTP] [primers] [DNA] [inibidores]
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Variações RT-PCR Multiplex PCR Nested PCR
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Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos
PCR Real Time PCR NASBA/TMA
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Principio de funcionamento do Real-Time PCR
2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda
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Detecção dos produtos de PCR
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Montar uma reacção
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Prof.Doutor José Cabeda
Químicas Utilizáveis 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda
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SYBR-Green I Excitation 5’ 3’ SG SG SG SG SG
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SYBR-Green I Excitation Emission SG SG 5’ 3’ SG SG SG
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Detcção com SybGreen
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Sybr-Green Detection Intercalates to dsDNA
Inhibits DNA amplification so concentration is critical Detects specific and non-specific targets Low starting background with large increase in signal Can run a melt curve to look at product specificity
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Detecção com sondas
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Quimicas utilizáveis: sondas taqman
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Sequence specific probes: Dual labeled probes
5’ 3’ Excitation Excitation 5’ 3’ Q R R R Q Q R Q
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Quimicas utilizáveis: molecular beacons
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Molecular Beacons I 10mer 25mer FAM DabCyl
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Molecular Beacons II Emission R Q Excitation R Q Q R X
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Molecular Beacons II Emission R Q Excitation R Q Q R X
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Molecular Beacons III Can be used to quantitation and mutation detection Need beacons for the normal and mutation sequence Design is difficult due to nature of folding structure Expensive when compared to FRET
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Quimicas utilizáveis: sondas FRET
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Prof.Doutor José Cabeda
Hyb-ProbesTM Emission Excitation Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: Quencher Transfer 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda
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Quenched FRET analysis
5’ 3’ Two labeled probes, FAM at the 5’ and BH1 on the 3’ When the probes hybridize the FAM energy is quenched by the BH1 After the product is amplified run a melt curve to determine genotype Different melt points are seen for normal and mutation
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Quimicas utilizáveis: sondas Eclipse
F Q MGB Q F
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Prof.Doutor José Cabeda
Aplicações Quantificação 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda
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End Point versus Real-Time
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Quantificação
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Detecção de Mutações / SNP
Aplicações Detecção de Mutações / SNP 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda
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Detecção de mutações
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Prof.Doutor José Cabeda
Aplicações Multiplex Detection 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda
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Detecção simultânea de vários produtos
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Prof.Doutor José Cabeda
Os equipamentos 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda
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Light Cycler
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Smartcycler
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Rotorgene The samples spin continually during a run at 500 rpm
The samples are heated and cooled in a low mass air oven Tubes are illuminated as they pass the detector On data acquisition energy is averaged over 20 revolutions to give the fluorescence of each sample Four Channels Ch1: ex 470nm, det 510nm Ch2: ex 530nm, det 550nm Ch3: ex 585nm, det 610nm Ch4: ex 625nm, det 660nm
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O Futuro próximo
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Detecção com sondas
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Detcção com SybGreen
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Quantificação
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Detecção de mutações
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Detecção simultânea de dois produtos
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Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos
PCR Real Time PCR NASBA/TMA
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NASBA/ NUCLISENS
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Amplification: schematic diagram
Primer 1 Legend: sense RNA antisense RNA sense DNA antisense DNA Reverse Transcriptase RNase H Primer 2 Reverse Transcriptase T7 RNA polymerase Primer 2 Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase RNase H Primer 1
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Técnicas de amplificação de Sinal
bDNA (Quantiplex)
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bDNA (I)
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bDNA (II)
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bDNA (III)
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bDNA (IV)
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bDNA (V)
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