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Genética Prof.Doutor José Cabeda Genética Molecular em Análises Clinicas TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

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1 Genética Prof.Doutor José Cabeda Genética Molecular em Análises Clinicas TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

2 Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR PCR Real Time PCR Real Time PCR NASBA/TMA NASBA/TMA

3 PCR

4

5 OPTIMIZAÇÃO DO PCR [MgCl 2 ] [MgCl 2 ] Th Th [dNTP] [dNTP] [primers] [primers] [DNA] [DNA] [inibidores] [inibidores]

6 Variações RT-PCR RT-PCR Multiplex PCR Multiplex PCR Nested PCR Nested PCR

7 Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR PCR Real Time PCR Real Time PCR NASBA/TMA NASBA/TMA

8 Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda Principio de funcionamento do Real-Time PCR

9

10 Detecção dos produtos de PCR

11 Montar uma reacção

12 Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda Químicas Utilizáveis

13 SYBR-Green I SG Excitation SG

14 SYBR-Green I SG Excitation Emission

15 Detcção com SybGreen

16 Sybr-Green Detection Intercalates to dsDNA Intercalates to dsDNA Inhibits DNA amplification so concentration is critical Inhibits DNA amplification so concentration is critical Detects specific and non- specific targets Detects specific and non- specific targets Low starting background with large increase in signal Low starting background with large increase in signal Can run a melt curve to look at product specificity Can run a melt curve to look at product specificity

17 Detecção com sondas

18 Quimicas utilizáveis: sondas taqman

19 R Q Sequence specific probes: Dual labeled probes Excitation R Q Q R Q R

20 Quimicas utilizáveis: molecular beacons

21 Molecular Beacons I 10mer 25mer FAM DabCyl

22 Molecular Beacons II R Q Excitation R Q Q R Emission

23 Molecular Beacons II R Q Excitation R Q Q R Emission

24 Can be used to quantitation and mutation detection Can be used to quantitation and mutation detection Need beacons for the normal and mutation sequence Need beacons for the normal and mutation sequence Design is difficult due to nature of folding structure Design is difficult due to nature of folding structure Expensive when compared to FRET Expensive when compared to FRET Molecular Beacons III

25 Quimicas utilizáveis: sondas FRET

26 Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda Hyb-Probes TM Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: Quencher Excitation Emission Transfer

27 Quenched FRET analysis Two labeled probes, FAM at the 5 and BH1 on the 3 Two labeled probes, FAM at the 5 and BH1 on the 3 When the probes hybridize the FAM energy is quenched by the BH1 When the probes hybridize the FAM energy is quenched by the BH1 After the product is amplified run a melt curve to determine genotype After the product is amplified run a melt curve to determine genotype Different melt points are seen for normal and mutation Different melt points are seen for normal and mutation 53

28 Quimicas utilizáveis: sondas Eclipse

29 Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda Aplicações Quantificação

30 End Point versus Real-Time

31 Quantificação

32 Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda Aplicações Detecção de Mutações / SNP

33 Detecção de mutações

34 Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda Aplicações Multiplex Detection

35 Detecção simultânea de vários produtos

36 Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda Os equipamentos

37 Light Cycler

38 Smartcycler

39 Rotorgene The samples spin continually during a run at 500 rpm The samples are heated and cooled in a low mass air oven Tubes are illuminated as they pass the detector On data acquisition energy is averaged over 20 revolutions to give the fluorescence of each sample Four Channels Ch1: ex 470nm, det 510nm Ch2: ex 530nm, det 550nm Ch3: ex 585nm, det 610nm Ch4: ex 625nm, det 660nm

40 O Futuro próximo

41 Detecção com sondas

42 Detcção com SybGreen

43 Quantificação

44 Detecção de mutações

45 Detecção simultânea de dois produtos

46 Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR PCR Real Time PCR Real Time PCR NASBA/TMA NASBA/TMA

47 NASBA/ NUCLISENS

48 Amplification: schematic diagram Primer 1 Reverse Transcriptase RNase H Primer 2 Reverse Transcriptase T7 RNA polymerase Primer 2 Reverse Transcriptase RNase H Primer 1 sense RNA antisense RNA sense DNA antisense DNA Legend:

49 Técnicas de amplificação de Sinal bDNA (Quantiplex) bDNA (Quantiplex)

50 bDNA (I)

51 bDNA (II)

52 bDNA (III)

53 bDNA (IV)

54 bDNA (V)


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