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Indução e caracterização molecular de mutantes PCR Banco sementes Detecção mutação EMS X Sequenciam.

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Apresentação em tema: "Indução e caracterização molecular de mutantes PCR Banco sementes Detecção mutação EMS X Sequenciam."— Transcrição da apresentação:

1 Indução e caracterização molecular de mutantes PCR Banco sementes Detecção mutação EMS X Sequenciam.

2 Vantagens do TILLING Produz grande especro de mutações pontuais (alélicas) Eficiente para genes pequenos Pode focar em regiões de interesse Aplicável para qualquer organismo Não transgênico

3 Detecção enzimática da mutação CEL I * * 1 CA Oleykowski, CRB Mullins, AK Godwin & AT Yeung, Mutation detection using a novel plant endonuclease Nucleic Acids Res. 26:4597 (1998)

4

5

6 IRD 700 IRD 800 Mapeamento de final duplo

7 TILLING com alta capacidade Banco de sementes PCR Digestão com Cel I * * * * * * * * Desnat. - + gel, scan - - Primers gene específicos Pool de DNA EMS * * * * * * * * Identificar mutantes seleção indivíduos PCR Sequenciar Desnat. e Renatur.

8 A typical 8-fold pool TILLING gel

9 GelBuddy calls the lanes

10 GelBuddy calibrates the lanes

11 Mark the bands

12

13 GelBuddy reports fragment sizes Zerr and Henikoff, NAR, 33;2806, 2005

14 384 well liquid handling 8 Li-Cors 8x pooling Production capacity = 12,000 samples/day With amplicons of 1500bp = ~ 16 Mb/day Projeto TILLING Seattle

15 PARSESNP * (Project Aligned Related Sequences and Evaluate SNPs) Taylor & Greene, NAR 31:3808, 2003

16 Two-dimensional arraying

17 Mutagenesis

18 Distribution of 1890 mutations in 192 TILLed fragments number of sequenced mutations per fragment

19 A:T<>G:C GAA simple repeat: 5 <> 6 <> indel 9 nt Types of polymorphisms identified

20 >99% G:C to A:T transitions 55 repeated mutations observed, ~56 expected EMS mutagenesis results in: C Exp some local bias G->A A T G Exp Obs


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