Indução e caracterização molecular de mutantes

Apresentação em tema: "Indução e caracterização molecular de mutantes"— Transcrição da apresentação:

1 Indução e caracterização molecular de mutantes
PCR Banco sementes Detecção mutação EMS X Sequenciam.

2 Vantagens do TILLING Produz grande especro de mutações pontuais (alélicas) Eficiente para genes pequenos Pode focar em regiões de interesse Aplicável para qualquer organismo Não transgênico 3

3 Detecção enzimática da mutação
* CEL I * 1 CA Oleykowski, CRB Mullins, AK Godwin & AT Yeung, ‘Mutation detection using a novel plant endonuclease’ Nucleic Acids Res. 26:4597 (1998)

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6 Mapeamento de final duplo
IRD 700 IRD 800

7 TILLING com alta capacidade
Banco de sementes EMS * - + Identificar mutantes seleção indivíduos PCR Sequenciar Desnat. e Renatur. Primers gene específicos Pool de DNA PCR * Digestão com Cel I * - * Desnat. - gel, scan * - * +

8 A typical 8-fold pool TILLING gel

9 GelBuddy calls the lanes

10 GelBuddy calibrates the lanes

11 Mark the bands

12 Mark the bands

13 GelBuddy reports fragment sizes
Zerr and Henikoff, NAR, 33;2806, 2005

14 Projeto TILLING Seattle
384 well liquid handling 8 Li-Cors 8x pooling Production capacity = 12,000 samples/day With amplicons of 1500bp = ~ 16 Mb/day

15 (Project Aligned Related Sequences and Evaluate SNPs)
PARSESNP* (Project Aligned Related Sequences and Evaluate SNPs) Taylor & Greene, NAR 31:3808, 2003

16 Two-dimensional arraying

17 Mutagenesis flower seed EMS or MNU MNU+NaN3 M1 M2 bank DNA and seed
M3 seed bank DNA and seed M1 M2 flower seed

18 Distribution of 1890 mutations in 192 TILLed fragments
Histogram with map on chromosomes number of sequenced mutations per fragment

19 Types of polymorphisms identified
A:T<>G:C GAA simple repeat: 5 <> 6 <> indel 9 nt

20 EMS mutagenesis results in:
• >99% G:C to A:T transitions • 55 repeated mutations observed, ~56 expected C Exp • some local bias G->A A T G -2 -1 +1 +2 Obs EMS mutagenesis, bias 3