The novel SAR-binding domain of scaffold attachment factor A (SAF-A) is a target in apoptotic nuclear breakdown The EMBO Journal Vol. 16 No. 24 pp.7361-7371,

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1 The novel SAR-binding domain of scaffold attachment factor A (SAF-A) is a target in apoptotic nuclear breakdown The EMBO Journal Vol. 16 No. 24 pp , 1997 Frank Göhring, Birgit L. Schwab, Pierluigi Nicotera, Marcel Leist and Frank O. Fackelmayer

2 Introdução A arquitetura do núcleo é organizada por uma proteína chamada “scaffold”. A SAF-A interage especificamente com o DNA nas regiões ricas em AT, SARs ou MARs. Participa do empacotamento e processamento do RNA, interagindo com ele. A proteína possui um domínio de ligação para SAR e um domínio de ligação para RNA, a RGG box. A clivagem da SAF-A por caspases é um importante passo na apoptose celular.

3 Resultados Figura 1. Curso do tempo da apoptose e da clivagem da SAF-A. Análise de células Jurkat em diferentes tempos de incubação com anticorpo anti-CD95.

4 Figura 2. Detecção da clivagem de SAF-A apartir de visualização nuclear in vivo
O DNA celular foi marcado com Hoechst e a SAF-A pode ser visualizada por imuno-fluorescência. Notar que o produto da clivagem é solúvel (SAF-A*).

5 Figura 3. A clivagem de SAF-A não altera sua associação com particulas hnRNP.
O extrto total de células apoptóticas e normais foi analizado em gel de poliacrilamida e em Western para verificar a evolução da SAF-A na apoptose

6 Figura 4. A porção amino- terminal da SAF-A possui um domínio de ligação para SAR DNA.
Vários fragmentos derivados da SAF-A foram construidos afim de localizar o região com o domínio de ligação ao SAR DNA.

7 Figura 5. Mapeamento do domínio de ligação ao SAR DNA da SAF-A.
Construções da região amino-terminal foram expressas em bacterias e marcadas com ZZ ou 6X His.

8 Figura 7. A sequencia espaçada de leucina é essencial para atividade de ligação ao DNA.
Fragmento N247 e versões mutantes foram analizadas quanto a atividade de ligação ao DNA.

9 Discussão A SAF-A parece ser a proteína ligante ao SAR mais abundante no núcleo. A clivagem da SAF-A por caspases ocasiona o colapso na cromatina e a fragmentação nuclear. A SAF-A não é a única proteína que se liga ao SAR no DNA, não sendo a única responsável pela morfologia apoptótica da célula. Existem dois sítios de ligação para ácidos nucléicos na SAF-A (RGG box e a porção amino terminal). A porção amino terminal possui dois domínios para SAR( aa 1-45 e aa ).

10 Micrografia eletrônica da interação SAF-A com SARs do DNA