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Transcrição e Processamento de RNA Bibliografia: Genes VII - Benjamin Lewin Biologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha Lenhinger Principles of Biochemistry.

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1 Transcrição e Processamento de RNA Bibliografia: Genes VII - Benjamin Lewin Biologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha Lenhinger Principles of Biochemistry (3a. Ed.) Agradecimentos: Profa. Dra. Aline Maria da Silva Instituto de Química- USP

2 Replicação Transcrição Tradução Proteína - Processo para síntese de todos os RNAs da célula - Reflete o estado fisiológico da célula - O conjunto de genes expressos em uma dada situação é variável - Processo catalisado pelas RNAs polimerases - Processo para síntese de todos os RNAs da célula - Reflete o estado fisiológico da célula - O conjunto de genes expressos em uma dada situação é variável - Processo catalisado pelas RNAs polimerases Transcrição Reversa Replicação de RNA

3 Principais Tipos de RNA RNA mensageiro (mRNA): contém a informação genética para a sequência de aminoácidos das proteínas RNA transportador (tRNA): identifica e transporta os aminoácidos até o ribossomo RNA ribossômico (rRNA): constituinte dos ribossomos

4 tRNA -Estrutura secundária com grampos e alças formando um trevo -Alto número de bases modificadas depois da sua transcrição

5 Bases modificadas nos tRNAs

6 Processamento do precursor do tRNA tRNA maduro Modificação das bases Processamento

7 Ribossomo bacteriano 70S (2,7 x 10 6 ) Ribossomo Eucariótico 80S (4,6 x 10 6 ) rRNAs:

8 Processamento do precursor do rRNA Metilação das bases Clivagem RNAs maduros RNA precursor 30S

9 Exemplos de rRNAs: - Estrutura secundária com grampos e alças - Bases metiladas

10 E.coli:

11 DNA fita codificadora DNA fita molde RNA transcrito Transcrição

12 Síntese de RNA: formação da ligação fosfodiester envolve o ataque nucleofílico do 3 OH da cadeia crescente no fosfato do carbono 5´do ribonucleosídeo trifosfatado que será incorporado A RNA polimerase não requer um iniciador (primer) para iniciar a síntese do RNA

13

14 Bolha de transcrição Fita molde RNA polimerase Direção da transcrição

15

16 RNA polimerase de E.coli

17 Ligação ao promotor Centro catalítico Reconhecimento específico do promotor As RNA polimerases não tem mecanismo de correção de erro (taxa de erro )

18 Promotores de genes bacterianos Região -10Região -35 Posição +1

19 Início da Transcrição Reconhecimento e Ligação ao promotor Deslocamento da subunidade sigma

20 Marcação do DNA com 32 P Tratamento com DNAse Separar os fragmentos em uma eletroforese em gel de poliacrilamida. Visualizar fragmentos após exposição a filme de Raio-X Regiões ligadas a RNA polimerase Footprinting de DNA

21 Substituição do fator sigma controla a iniciação: Os distintos fatores sigma reconhecem promotores diferentes

22 Bolha de transcrição Fita molde RNA polimerase Direção da transcrição 5´ 3´

23 Terminação da transcrição através da formação do grampo de terminação

24 Terminação da transcrição dependente da proteína Rho Rho (46kDa, ativa como hexâmero) move-se ao longo do RNA acompanhando a RNA polimerase Com a pausa da RNA polimerase na sequência de terminação, Rho alcança a enzima Rho desenrola o híbrido RNA-DNA Sequência de Terminação dependente de Rho: rica em C

25 A RNA polimerase bacteriana é inibida por rifamicina (liga a subunidade beta) A subunidade beta da RNA pol contem 5 sítios de ligação para rifamicina O antibiótico previne o início da síntese da cadeia de RNA, imediatamente após a formação da primeira ligação fosfodiester

26 Agentes intercalantes inibem tanto a transcrição com a replicação, em procariotos e eucariotos Actnomicina D Acridina

27 0 gene geralmente é maior do que a sequência codificadora para a proteína 5´UTR 3´UTR Proteína UTR: Região não traduzida (Untranslated region)

28 0 mRNA bacteriano pode ser policistrônico (poligênico) Distância intergênica (-1 a 40 bases) Gene AGene B 3´UTR 5´UTR fim início fim início

29 Etapas envolvidas na expressão de genes em eucariotos Transcrição Processamento Transporte Tradução Citoplasma Núcleo

30 RNA polimerases de eucariotos RNA pol INucleólorRNAVárias subunidades RNA pol IINucleoplasmahnRNA (transcrito primário) snRNA Várias subunidades RNA pol IIINucleoplasmarRNA 5S tRNAs Várias subunidades RNA pol Mitocondrial Mitocondria01 subunidade RNA pol de Cloroplastos CloroplastoSimilar as bacterianas Requerem proteínas auxiliares: fatores de transcrição

31 A RNA polimerase II é inibida especificamente por -amanitina Isolado do cogumelo Amanita phalloides Altamente tóxico Bloqueia a etapa de elongação

32 Estrutura típica de um gene transcrito pela RNApol II Promotor Enhancer Gene

33 Estrutura de Promotores da RNA Pol II

34 Promotores de genes transcritos pela RNApol II Tata Binding Protein Complexo TFIID

35 Promotores de genes transcritos pela RNApol III e I: A TBP também é componente dos complexos de iniciação de transcrição destes promotores

36 Domínios dos Fatores de Transcrição Domínio de Ativação Domínio conector Domínio de ligação ao DNA

37 Proteínas necessárias para transcrição a partir de promotores reconhecidos pela RNA Pol II

38

39 Procariotos Eucariotos Splicing

40 Adição do 5´CAP (modificação da extremidade 5´do hnRNA)

41 Etapas para geração do transcrito maduro (hnRNA) Transcrição e adição do 5´cap Clivagem, poliadenilação e splicing

42 Poliadenilação: Adição da cauda poli (A) na extremidade 3´do hnRNA (transcrito primário): ~200 Adeninas Sequencia sinal para poliadenilação

43 (hnRNA) Genes eucarióticos são em geral interrompidos por introns Splicing: remoção dos introns

44 Mamíferos tem maior número de exons/gene número de

45 Tamanho de introns em vertebrados é variado Exons que codificam para proteínas são usualmente pequenos

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49 Remoção de introns pelo spliceossomo: associação de ribonucleoproteínas pequenas (snRNPs) formando um complexo de 3x10 3 kDa AGGUAAGU-----Pyr---A--NCAGG

50 Auto-splicing:introns do grupo I

51

52 Auto-splicing: introns do grupo II


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