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Transcrição e Processamento de RNA
Agradecimentos: Profa. Dra. Aline Maria da Silva Instituto de Química- USP Bibliografia: Genes VII - Benjamin Lewin Biologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha Lenhinger Principles of Biochemistry (3a. Ed.)
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Replicação Transcrição Tradução Proteína
Processo para síntese de todos os RNAs da célula Reflete o estado fisiológico da célula O conjunto de genes expressos em uma dada situação é variável Processo catalisado pelas RNAs polimerases Replicação Transcrição Transcrição Reversa Replicação de RNA Tradução Proteína
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Principais Tipos de RNA
RNA mensageiro (mRNA): contém a informação genética para a sequência de aminoácidos das proteínas RNA transportador (tRNA): identifica e transporta os aminoácidos até o ribossomo RNA ribossômico (rRNA): constituinte dos ribossomos
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tRNA -Estrutura secundária com grampos e alças formando um trevo
-Alto número de bases modificadas depois da sua transcrição
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Bases modificadas nos tRNAs
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Processamento do precursor do tRNA
tRNA maduro Modificação das bases Processamento
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Ribossomo Eucariótico
Ribossomo bacteriano 70S (2,7 x 106) Ribossomo Eucariótico 80S (4,6 x 106) rRNAs:
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Processamento do precursor do rRNA
Metilação das bases Clivagem RNAs maduros RNA precursor 30S
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Exemplos de rRNAs: Estrutura secundária com grampos e alças Bases metiladas
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E.coli:
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Transcrição DNA fita codificadora DNA fita molde RNA transcrito
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Síntese de RNA: formação da ligação fosfodiester envolve o ataque nucleofílico do 3’ OH da cadeia crescente no fosfato do carbono 5´do ribonucleosídeo trifosfatado que será incorporado A RNA polimerase não requer um iniciador (primer) para iniciar a síntese do RNA
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Bolha de transcrição RNA polimerase Fita molde Direção da transcrição
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Direção da transcrição
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RNA polimerase de E.coli
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RNA polimerase de E.coli
Ligação ao promotor RNA polimerase de E.coli As RNA polimerases não tem mecanismo de correção de erro (taxa de erro 10-5) Centro catalítico Reconhecimento específico do promotor
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Promotores de genes bacterianos
Posição +1 Região -35 Região -10
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Reconhecimento e Ligação ao promotor Deslocamento da subunidade sigma
Início da Transcrição Deslocamento da subunidade sigma
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Footprinting de DNA Regiões ligadas a RNA polimerase
Marcação do DNA com 32P Footprinting de DNA Tratamento com DNAse Regiões ligadas a RNA polimerase Separar os fragmentos em uma eletroforese em gel de poliacrilamida. Visualizar fragmentos após exposição a filme de Raio-X
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Substituição do fator sigma controla a iniciação: Os distintos fatores sigma reconhecem promotores diferentes
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Direção da transcrição
Bolha de transcrição RNA polimerase Fita molde Direção da transcrição 5´ ´
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Terminação da transcrição através da formação do grampo de terminação
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Terminação da transcrição dependente da proteína Rho
Rho (46kDa, ativa como hexâmero) move-se ao longo do RNA acompanhando a RNA polimerase Com a pausa da RNA polimerase na sequência de terminação, Rho alcança a enzima Rho desenrola o híbrido RNA-DNA Sequência de Terminação dependente de Rho: rica em C
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A RNA polimerase bacteriana é inibida por rifamicina (liga a subunidade beta)
A subunidade beta da RNA pol contem 5 sítios de ligação para rifamicina O antibiótico previne o início da síntese da cadeia de RNA, imediatamente após a formação da primeira ligação fosfodiester
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Agentes intercalantes inibem tanto a transcrição com a replicação, em procariotos e eucariotos
Actnomicina D Acridina
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0 gene geralmente é maior do que a sequência codificadora para a proteína
5´UTR 3´UTR Proteína UTR: Região não traduzida (Untranslated region)
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0 mRNA bacteriano pode ser policistrônico (poligênico)
Distância intergênica (-1 a 40 bases) Gene A Gene B 3´UTR 5´UTR fim início
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Etapas envolvidas na expressão de genes em eucariotos
Núcleo Etapas envolvidas na expressão de genes em eucariotos Transcrição Processamento Transporte Tradução Citoplasma
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RNA polimerases de eucariotos
Nucleólo rRNA Várias subunidades RNA pol II Nucleoplasma hnRNA (transcrito primário) snRNA RNA pol III rRNA 5S tRNAs RNA pol Mitocondrial Mitocondria 01 subunidade RNA pol de Cloroplastos Cloroplasto Similar as bacterianas Requerem proteínas auxiliares: fatores de transcrição
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A RNA polimerase II é inibida especificamente por -amanitina
Isolado do cogumelo Amanita phalloides Altamente tóxico Bloqueia a etapa de elongação
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Estrutura típica de um gene transcrito pela RNApol II
Enhancer Promotor Gene
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Estrutura de Promotores da RNA Pol II
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Promotores de genes transcritos pela RNApol II
Tata Binding Protein Complexo TFIID
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Promotores de genes transcritos pela RNApol III e I:
A TBP também é componente dos complexos de iniciação de transcrição destes promotores
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Domínios dos Fatores de Transcrição
Domínio de Ativação Domínio conector Domínio de ligação ao DNA
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Proteínas necessárias para transcrição a partir de promotores reconhecidos pela RNA Pol II
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Eucariotos Procariotos
Splicing
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(modificação da extremidade 5´do hnRNA)
Adição do 5´CAP
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Etapas para geração do transcrito maduro
Transcrição e adição do 5´cap (hnRNA) Clivagem, poliadenilação e splicing
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Sequencia sinal para poliadenilação
Adição da cauda poli (A) na extremidade 3´do hnRNA (transcrito primário): ~200 Adeninas Sequencia sinal para poliadenilação
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Genes eucarióticos são em geral interrompidos por introns
(hnRNA) Splicing: remoção dos introns Genes eucarióticos são em geral interrompidos por introns
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Mamíferos tem maior número de exons/gene número de
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Tamanho de introns em vertebrados é variado
Exons que codificam para proteínas são usualmente pequenos
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AGGUAAGU-----Pyr---A--NCAGG
Remoção de introns pelo “spliceossomo”: associação de ribonucleoproteínas pequenas (snRNPs) formando um complexo de 3x103 kDa
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Auto-splicing:introns do grupo I
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Auto-splicing: introns do grupo I
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Auto-splicing: introns do grupo II
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