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Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Avaliação do repertório TCR.

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Apresentação em tema: "Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Avaliação do repertório TCR."— Transcrição da apresentação:

1 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Avaliação do repertório TCR

2 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Escolha das regiões génicas a estudar Regiões V Regiões V Limitado na variabilidade Limitado na variabilidade Passível de estudo por citometria Passível de estudo por citometria CDR1 e CDR2 CDR1 e CDR2 Variabilidade limitada à região V Variabilidade limitada à região V CDR3 CDR3 O mais variável O mais variável Contribuição de V,D e J Contribuição de V,D e J Variabilidade Variabilidade Sequência Sequência Tamanho Tamanho

3 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Purificar as células a estudar CD4 / CD8 CD4 / CD8 Variabilidade de uma pode obscurecer alterações na outra Variabilidade de uma pode obscurecer alterações na outra Repertório muito diferente Repertório muito diferente Local em estudo Local em estudo Sangue periférico Sangue periférico Tecidos infectado/tumor Tecidos infectado/tumor Nódulos linfáticos Nódulos linfáticos

4 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Selecção da Técnica

5 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Southern Blot

6 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda

7 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Multiplex PCR for CDR3 length

8 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Electroforese Capilar (II) Fluxo Electro-osmótico (FEO): Fluxo Electro-osmótico (FEO): A superfície do capilar de vidro-silica contém grupos funcionais carregados negativamente, os quais atraem iões carregados positivamente. Estes iões migram para o pólo negativo, carregando consigo moléculas do solvente. A superfície do capilar de vidro-silica contém grupos funcionais carregados negativamente, os quais atraem iões carregados positivamente. Estes iões migram para o pólo negativo, carregando consigo moléculas do solvente. Moléculas neutras viajam á velocidade do FEO Moléculas neutras viajam á velocidade do FEO Moléculas positivas são mais rápidas que o FEO Moléculas positivas são mais rápidas que o FEO Moléculas negativas são mais lentas que o FEO Moléculas negativas são mais lentas que o FEO todas as moléculas migram para o pólo negativo (com velocidade que depende da sua carga e do seu peso molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de aparelhagem utilizado em HPLC. todas as moléculas migram para o pólo negativo (com velocidade que depende da sua carga e do seu peso molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de aparelhagem utilizado em HPLC.

9 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Electroforese capilar (III)

10 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda

11 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Métodos baseados na conformação Conformação do dsDNA Conformação do dsDNA não depende da sequência não depende da sequência A conformação de homodupletos é diferente da dos heterodupletos A conformação de homodupletos é diferente da dos heterodupletos A conformação dos heterodupletos depende da sequencia de mismatch A conformação dos heterodupletos depende da sequencia de mismatch Conformação do ssDNA Conformação do ssDNA depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência) depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência)

12 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Single Strand Conformation Polimorfism (SSCP) dsDNA é desnaturado dsDNA é desnaturado dsDNA é diluido dsDNA é diluido Renaturação rápida Renaturação rápida Corrida em condições semi- desnaturantes e a temperaturas fixas Corrida em condições semi- desnaturantes e a temperaturas fixas Resultado depende muito de: Resultado depende muito de: Temperatura de corrida Temperatura de corrida Concentração de desnaturante Concentração de desnaturante Presença de certos químicos (ex: glicerol, etc) Presença de certos químicos (ex: glicerol, etc) WT1 WT2 mutantes

13 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Heteroduplex Analysis (HA) Heterodupletos causam Heterodupletos causam Distorção na conformação Distorção na conformação Migração no gel mais lenta Migração no gel mais lenta Heterodupletos podem existir por: Heterodupletos podem existir por: Co-amplificação por PCR de heterozigotos Co-amplificação por PCR de heterozigotos Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+M Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+M

14 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Heteroduplex Analysis (HA) Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou DEM) aumenta a sensibilidade da HA Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou DEM) aumenta a sensibilidade da HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente semi-desnaturante que aumenta a resolução do HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente semi-desnaturante que aumenta a resolução do HA

15 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Citometria de Fluxo

16 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Análise de activação celular

17 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda

18 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda

19 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Medida da função precoce de receptores: ensaio de activação CD69 CD2 crosslinking CD2 crosslinking CD2-biot + avidina CD2-biot + avidina Colher sangue Colher sangue Incubar c/ CD2/2R-avidina 4h-37ºC Incubar c/ CD2/2R-avidina 4h-37ºC Lavar Lavar Marcar c/ Marcar c/ CD4/CD69/CD3 CD4/CD69/CD3 CD8/CD69/CD3 CD8/CD69/CD3 Lavar Lavar Fixar Fixar Analisar em citómetro Analisar em citómetro

20 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Titular no tempo o efeito do activador

21 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Medida da expressão de receptores pós activação: ensaio quantitativo Muitas moléculas variam de expressão no decorrer da activação Muitas moléculas variam de expressão no decorrer da activação CD95(fas)CD38,CD26, CD25, receptores de quimoquinas (CXCR4, CCR3, CCR5) CD95(fas)CD38,CD26, CD25, receptores de quimoquinas (CXCR4, CCR3, CCR5) Colher sangue Colher sangue Marcar células Marcar células Correr no citómetro juntamente com painel beads p/ calibração da Intensidade de fluorescência Correr no citómetro juntamente com painel beads p/ calibração da Intensidade de fluorescência

22 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Medida da activação celular: concentração intracelular de Ca 2+ Colher sangue Colher sangue Separar cel.mononucleares Separar cel.mononucleares cultivar em meio de cultura c/ PHA 3 dias em 5%CO 2 cultivar em meio de cultura c/ PHA 3 dias em 5%CO 2 Cultivar 4 dias em meio c/ IL2 Cultivar 4 dias em meio c/ IL2 Adicionar INDO-1 Adicionar INDO-1 Incubar 40 min-31ºC Incubar 40 min-31ºC Lavar Lavar Incubar 5min-37ºC Incubar 5min-37ºC Ler no citometro 30 seg. Ler no citometro 30 seg. Interromper p/ Activar Interromper p/ Activar Ler no citometro Ler no citometro

23 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Análise de Função celular 2 – Função das células fagociticas

24 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Definir a população de monócitos FSC/SSC FSC/SSC SSC/CD14 SSC/CD14 SSC/CD16 SSC/CD16 HLA-DR pode também ajudar: HLA-DR pode também ajudar: Monocitos HLA-DR + Monocitos HLA-DR + Granulócitos HLA-DR - Granulócitos HLA-DR -

25 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Definir a população de granulócitos FSC/SSC FSC/SSC SSC/CD33 SSC/CD33

26 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Avaliação do aumento de expressão de integrinas 2 Integrinas b2 Integrinas b2 CD11a (LFA1) expresso em todos os leucócitos CD11a (LFA1) expresso em todos os leucócitos CD11b,CD11c expressos em monocitos, granulócitos e Nk CD11b,CD11c expressos em monocitos, granulócitos e Nk Partilham a cadeia (CD18) Partilham a cadeia (CD18) Mutações em CD18 originam LAD1 (leucocyte adesion deficiency type 1) Mutações em CD18 originam LAD1 (leucocyte adesion deficiency type 1) Estimular PBMC c/ PMA 15-37ºC Estimular PBMC c/ PMA 15-37ºC Preparar 1 tubo sem estimulação Preparar 1 tubo sem estimulação Marcar c/ CD11b Marcar c/ CD11b Preparar tb um control IgG2a Preparar tb um control IgG2a Fixar Fixar Analisar em citómetro Analisar em citómetro

27 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Estudo de expressão de FcReceptor 3 FcReceptors: 3 FcReceptors: CD16 CD16 CD32 CD32 CD64 CD64 CD64 aumenta rápidamente em monócitos e granulócitos em resposta a IFN-, GCSF (não GMCSF) e IL12 CD64 aumenta rápidamente em monócitos e granulócitos em resposta a IFN-, GCSF (não GMCSF) e IL12 Marcação standard com -CD64 utilizando beads standard para intensidade de fluorescência para a quantificação Marcação standard com -CD64 utilizando beads standard para intensidade de fluorescência para a quantificação Útil para Útil para Confirmação de um processo inflamatório agudo Confirmação de um processo inflamatório agudo Monitorizar e ajustar a dose em doentes a receber IFN- Monitorizar e ajustar a dose em doentes a receber IFN-

28 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Estudo de quimiotaxia Estudo é possível, mas não é frequente no laboratório de análises clinicas Estudo é possível, mas não é frequente no laboratório de análises clinicas

29 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Estudo de fagocitose Colher sangue em heparina (citrato e EDTA reduzem fagocitose) Colher sangue em heparina (citrato e EDTA reduzem fagocitose) Arrefecer o sangue em gelo-15min Arrefecer o sangue em gelo-15min Misturar c/ E.coli marcadas c/ FITC e opsinizadas c/Ig e complemento (pool de soro) Misturar c/ E.coli marcadas c/ FITC e opsinizadas c/Ig e complemento (pool de soro) Incubar 1 tubo a 37ºC e outro em gelo (control neg.) Incubar 1 tubo a 37ºC e outro em gelo (control neg.) Colocar em gelo Colocar em gelo Adicionar sol quenching fria para impedir a fluorescência devida a bactérias não internalizadas, mas ligadas à membrana no fagocito Adicionar sol quenching fria para impedir a fluorescência devida a bactérias não internalizadas, mas ligadas à membrana no fagocito Lavar Lavar Adicionar sol.lise (lise de eritrócitos e fixação dos leucócitos) Adicionar sol.lise (lise de eritrócitos e fixação dos leucócitos) Analisar em citómetro em 30 min. Analisar em citómetro em 30 min. Adicionalmente pode-se marcar vas células c/ -CD14 e -CD33 Adicionalmente pode-se marcar vas células c/ -CD14 e -CD33

30 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Estudo de Killing A morte induzida pelos fagócitos é primáriamente o resultado da geração de radicais de oxigénio activos (RO) A morte induzida pelos fagócitos é primáriamente o resultado da geração de radicais de oxigénio activos (RO) A principal via de geração de RO é a via da NADPH oxidase A principal via de geração de RO é a via da NADPH oxidase Deficiencias genéticas nestas enzimas originam CGD (doença granulomatose crónica). Deficiencias genéticas nestas enzimas originam CGD (doença granulomatose crónica). Na presença de Peroxidases e H2O2, PMNs normais convenientemente estimulados oxidam o corante DHR-123 a rodamina.123, tornando as células fluorescentes. As células de doentes com CGD não metabolizam o corante. Na presença de Peroxidases e H2O2, PMNs normais convenientemente estimulados oxidam o corante DHR-123 a rodamina.123, tornando as células fluorescentes. As células de doentes com CGD não metabolizam o corante.

31 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Análise de Função celular 3 – Apoptose

32 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Colher sangue C/ anticoagulante Colher sangue C/ anticoagulante Manter o sangue sempre a RT Manter o sangue sempre a RT Processar de imediato e nunca depois de 6h pós-colheita Processar de imediato e nunca depois de 6h pós-colheita Preparar PBMC Preparar PBMC

33 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Detecção de células c/ menor conteúdo de DNA (subdiplóides) lavar cels em HBSS lavar cels em HBSS Ressuspender (106 cells) em ET-OH Ressuspender (106 cells) em ET-OH Incubar 1 h a 4ºC Incubar 1 h a 4ºC Remover sobrenadante (SN) Remover sobrenadante (SN) Adicionar HBSS,RNAse e PI Adicionar HBSS,RNAse e PI Incubar 15 min a RT Incubar 15 min a RT Manter a 4ºC no escuro Manter a 4ºC no escuro Ler no citómetro Ler no citómetro Activação de endonucleases origina a degradação de DNA Activação de endonucleases origina a degradação de DNA PI (iodeto de propidium) é um fluorocromo com afinidade para DNA PI (iodeto de propidium) é um fluorocromo com afinidade para DNA DNA fica fluorescente DNA fica fluorescente Intensidade de fluorescência é proporcional á quantidade de DNA/célula Intensidade de fluorescência é proporcional á quantidade de DNA/célula

34 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Detecção de células subdiplóides (Ex.)

35 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Detecção de células c/ quebras no DNA (Método TUNEL) Introdução de dUTP-FITC nas quebras do DNA pela TdT Introdução de dUTP-FITC nas quebras do DNA pela TdT Incubar c/ permeafix 40-RT Incubar c/ permeafix 40-RT Lavar Lavar Ressuspender na sol. Marcação contendo TdT, tampão, dUTP- FITC Ressuspender na sol. Marcação contendo TdT, tampão, dUTP- FITC Incubar 1h-37ºC Incubar 1h-37ºC Lavar Lavar Ler no citometro Ler no citometro

36 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Método TUNEL (Ex.)

37 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Detecção de células c/ fosfatidilserina translocada Método da anexina V A fosfatidilserina encontra-se habitualmente apenas no folheto interno da membrana A fosfatidilserina encontra-se habitualmente apenas no folheto interno da membrana Em células apoptóticas a assimetria membranar perde-se expondo fosfatidilserina Em células apoptóticas a assimetria membranar perde-se expondo fosfatidilserina A Anexina V é capaz de se ligar à fosfatidilserina A Anexina V é capaz de se ligar à fosfatidilserina

38 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Método da anexina V (Ex.)

39 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Estudos de citocinas

40 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Estudos de citocinas Em condições normais não são detectáveis citoquinas nos fluidos biológicos Em condições normais não são detectáveis citoquinas nos fluidos biológicos A presença de citoquinas nos fluidos biológicos é caracteristica A presença de citoquinas nos fluidos biológicos é caracteristica de situações patológicas de situações patológicas De estadios de situações patológicas De estadios de situações patológicas As citoquinas podem ser estudadas por: As citoquinas podem ser estudadas por: Imunoensaios (ELISA, RIA) Imunoensaios (ELISA, RIA) Bioensaios Bioensaios Citometria Citometria Métodos moleculares Métodos moleculares

41 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Detecção de citoquinas: ELISA

42 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Bioensaios Uso de uma linha celular que responde à presença de uma citocina Uso de uma linha celular que responde à presença de uma citocina Cultura da linha celular na presença e na ausência de fluido a testar, e na presença da citocina recombinante. Cultura da linha celular na presença e na ausência de fluido a testar, e na presença da citocina recombinante. A medida da actividade celular é indicadora da presença/ausência de citocina A medida da actividade celular é indicadora da presença/ausência de citocina Tipos de bioensaios (actividade celular medida) Tipos de bioensaios (actividade celular medida) Actividade citotoxica Actividade citotoxica Proliferação Proliferação Função celular específica Função celular específica Quantidade de uma proteína induzida Quantidade de uma proteína induzida

43 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Activation of M in vitro +/- Cytokine secretion Remove cytokine containing supernatant Test for effect on other cells Which cytokine? Detecção de citoquinas:Bioensaios

44 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Include an antibody that blocks interleukin-1 Test for a characteristic effect on other cells e.g. interleukin-1 Induces proliferation in thymocytes - IL-1 present + IL-1 absent + Especificidade dos bioensaios

45 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Citometria de fluxo Estimular as células Estimular as células Mitogénio Mitogénio Ag+coestimuladores ( -CD28+ -CD49d) Ag+coestimuladores ( -CD28+ -CD49d) Bloquear a secreção de citoquinas (brefeldin –BfA ou monensin) Bloquear a secreção de citoquinas (brefeldin –BfA ou monensin) Lisar os eritrócitos e fixar Lisar os eritrócitos e fixar Permeabilizar as células Permeabilizar as células Marcar com anticorpo Marcar com anticorpo Analisar Analisar

46 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Detecção de IFN- por citometria

47 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Ensaios Moleculares


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