Avaliação do repertório TCR

Apresentação em tema: "Avaliação do repertório TCR"— Transcrição da apresentação:

1 Avaliação do repertório TCR
Prof.Doutor José Cabeda

2 Escolha das regiões génicas a estudar
Regiões V Limitado na variabilidade Passível de estudo por citometria CDR1 e CDR2 Variabilidade limitada à região V CDR3 O mais variável Contribuição de V,D e J Variabilidade Sequência Tamanho Prof. Doutor José Cabeda

3 Purificar as células a estudar
CD4 / CD8 Variabilidade de uma pode obscurecer alterações na outra Repertório muito diferente Local em estudo Sangue periférico Tecidos infectado/tumor Nódulos linfáticos Prof. Doutor José Cabeda

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Selecção da Técnica Prof. Doutor José Cabeda

5 Prof. Doutor José Cabeda
Southern Blot Prof. Doutor José Cabeda

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7 Multiplex PCR for CDR3 length
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8 Electroforese Capilar (II)
Fluxo Electro-osmótico (FEO): A superfície do capilar de vidro-silica contém grupos funcionais carregados negativamente, os quais atraem iões carregados positivamente. Estes iões migram para o pólo negativo, carregando consigo moléculas do solvente. Moléculas neutras viajam á velocidade do FEO Moléculas positivas são mais rápidas que o FEO Moléculas negativas são mais lentas que o FEO todas as moléculas migram para o pólo negativo (com velocidade que depende da sua carga e do seu peso molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de aparelhagem utilizado em HPLC. Prof. Doutor José Cabeda

9 Electroforese capilar (III)
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11 Métodos baseados na conformação
Conformação do dsDNA não depende da sequência A conformação de homodupletos é diferente da dos heterodupletos A conformação dos heterodupletos depende da sequencia de “mismatch” Conformação do ssDNA depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência) Prof. Doutor José Cabeda

12 Single Strand Conformation Polimorfism (SSCP)
dsDNA é desnaturado dsDNA é diluido Renaturação rápida Corrida em condições semi-desnaturantes e a temperaturas fixas Resultado depende muito de: Temperatura de corrida Concentração de desnaturante Presença de certos químicos (ex: glicerol, etc) WT1 mutantes WT2 Prof. Doutor José Cabeda

13 Heteroduplex Analysis (HA)
Heterodupletos causam Distorção na conformação Migração no gel mais lenta Heterodupletos podem existir por: Co-amplificação por PCR de heterozigotos Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+M Prof. Doutor José Cabeda

14 Heteroduplex Analysis (HA)
Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou DEM) aumenta a sensibilidade da HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente semi-desnaturante que aumenta a resolução do HA Prof. Doutor José Cabeda

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Citometria de Fluxo Prof. Doutor José Cabeda

16 Análise de activação celular
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19 Medida da função precoce de receptores: ensaio de activação CD69
CD2 “crosslinking” aCD2-biot + avidina Colher sangue Incubar c/ aCD2/2R-avidina 4h-37ºC Lavar Marcar c/ CD4/CD69/CD3 CD8/CD69/CD3 Fixar Analisar em citómetro Prof. Doutor José Cabeda

20 Titular no tempo o efeito do activador
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21 Medida da expressão de receptores pós activação: ensaio quantitativo
Muitas moléculas variam de expressão no decorrer da activação CD95(fas)CD38,CD26, CD25, receptores de quimoquinas (CXCR4, CCR3, CCR5) Colher sangue Marcar células Correr no citómetro juntamente com painel beads p/ calibração da Intensidade de fluorescência Prof. Doutor José Cabeda

22 Medida da activação celular: concentração intracelular de Ca2+
Colher sangue Separar cel.mononucleares cultivar em meio de cultura c/ PHA 3 dias em 5%CO2 Cultivar 4 dias em meio c/ IL2 Adicionar INDO-1 Incubar 40 min-31ºC Lavar Incubar 5min-37ºC Ler no citometro 30 seg. Interromper p/ Activar Ler no citometro Prof. Doutor José Cabeda

23 Análise de Função celular
2 – Função das células fagociticas Prof.Doutor José Cabeda

24 Definir a população de monócitos
FSC/SSC SSC/CD14 SSC/CD16 HLA-DR pode também ajudar: Monocitos HLA-DR+ Granulócitos HLA-DR- Prof. Doutor José Cabeda

25 Definir a população de granulócitos
FSC/SSC SSC/CD33 Prof. Doutor José Cabeda

26 Avaliação do aumento de expressão de integrinas b2
CD11a (LFA1) expresso em todos os leucócitos CD11b,CD11c expressos em monocitos, granulócitos e Nk Partilham a cadeia b (CD18) Mutações em CD18 originam LAD1 (leucocyte adesion deficiency type 1) Estimular PBMC c/ PMA 15’-37ºC Preparar 1 tubo sem estimulação Marcar c/ CD11b Preparar tb um control IgG2a Fixar Analisar em citómetro Prof. Doutor José Cabeda

27 Estudo de expressão de FcReceptor
3 FcReceptors: CD16 CD32 CD64 CD64 aumenta rápidamente em monócitos e granulócitos em resposta a IFN-g, GCSF (não GMCSF) e IL12 Marcação standard com a-CD64 utilizando beads standard para intensidade de fluorescência para a quantificação Útil para Confirmação de um processo inflamatório agudo Monitorizar e ajustar a dose em doentes a receber IFN-g Prof. Doutor José Cabeda

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Estudo de quimiotaxia Estudo é possível, mas não é frequente no laboratório de análises clinicas Prof. Doutor José Cabeda

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Estudo de fagocitose Colher sangue em heparina (citrato e EDTA reduzem fagocitose) Arrefecer o sangue em gelo-15min Misturar c/ E.coli marcadas c/ FITC e opsinizadas c/Ig e complemento (pool de soro) Incubar 1 tubo a 37ºC e outro em gelo (control neg.) Colocar em gelo Adicionar sol quenching fria para impedir a fluorescência devida a bactérias não internalizadas, mas ligadas à membrana no fagocito Lavar Adicionar sol.lise (lise de eritrócitos e fixação dos leucócitos) Analisar em citómetro em 30 min. Adicionalmente pode-se marcar vas células c/ a-CD14 e a-CD33 Prof. Doutor José Cabeda

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Estudo de “Killing” A morte induzida pelos fagócitos é primáriamente o resultado da geração de radicais de oxigénio activos (RO) A principal via de geração de RO é a via da NADPH oxidase Deficiencias genéticas nestas enzimas originam CGD (doença granulomatose crónica). Na presença de Peroxidases e H2O2, PMN’s normais convenientemente estimulados oxidam o corante DHR-123 a rodamina.123, tornando as células fluorescentes. As células de doentes com CGD não metabolizam o corante. Prof. Doutor José Cabeda

31 Análise de Função celular
3 – Apoptose Prof.Doutor José Cabeda

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Colher sangue C/ anticoagulante Manter o sangue sempre a RT Processar de imediato e nunca depois de 6h pós-colheita Preparar PBMC Prof. Doutor José Cabeda

33 Detecção de células c/ menor conteúdo de DNA (subdiplóides)
Activação de endonucleases origina a degradação de DNA PI (iodeto de propidium) é um fluorocromo com afinidade para DNA DNA fica fluorescente Intensidade de fluorescência é proporcional á quantidade de DNA/célula lavar cels em HBSS Ressuspender (106 cells) em ET-OH Incubar 1 h a 4ºC Remover sobrenadante (SN) Adicionar HBSS,RNAse e PI Incubar 15 min a RT Manter a 4ºC no escuro Ler no citómetro Prof. Doutor José Cabeda

34 Detecção de células subdiplóides (Ex.)
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35 Detecção de células c/ quebras no DNA (Método TUNEL)
Introdução de dUTP-FITC nas quebras do DNA pela TdT Incubar c/ permeafix 40’-RT Lavar Ressuspender na sol. Marcação contendo TdT, tampão, dUTP-FITC Incubar 1h-37ºC Ler no citometro Prof. Doutor José Cabeda

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Método TUNEL (Ex.) Prof. Doutor José Cabeda

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Detecção de células c/ fosfatidilserina translocada Método da anexina V A fosfatidilserina encontra-se habitualmente apenas no folheto interno da membrana Em células apoptóticas a assimetria membranar perde-se expondo fosfatidilserina A Anexina V é capaz de se ligar à fosfatidilserina Prof. Doutor José Cabeda

38 Método da anexina V (Ex.)
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Estudos de citocinas Prof.Doutor José Cabeda

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Estudos de citocinas Em condições normais não são detectáveis citoquinas nos fluidos biológicos A presença de citoquinas nos fluidos biológicos é caracteristica de situações patológicas De estadios de situações patológicas As citoquinas podem ser estudadas por: Imunoensaios (ELISA, RIA) Bioensaios Citometria Métodos moleculares Prof. Doutor José Cabeda

41 Detecção de citoquinas: ELISA
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Bioensaios Uso de uma linha celular que responde à presença de uma citocina Cultura da linha celular na presença e na ausência de fluido a testar, e na presença da citocina recombinante. A medida da actividade celular é indicadora da presença/ausência de citocina Tipos de bioensaios (actividade celular medida) Actividade citotoxica Proliferação Função celular específica Quantidade de uma proteína induzida Prof. Doutor José Cabeda

43 Detecção de citoquinas:Bioensaios
Activation of M in vitro Test for effect on other cells Cytokine secretion +/- Remove cytokine containing supernatant Which cytokine? Prof. Doutor José Cabeda

44 Especificidade dos bioensaios
Test for a characteristic effect on other cells e.g. interleukin-1 Induces proliferation in thymocytes Include an antibody that blocks interleukin-1 + + IL-1 absent - IL-1 present Prof. Doutor José Cabeda

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Citometria de fluxo Estimular as células Mitogénio Ag+coestimuladores (a-CD28+ a-CD49d) Bloquear a secreção de citoquinas (brefeldin –BfA ou monensin) Lisar os eritrócitos e fixar Permeabilizar as células Marcar com anticorpo Analisar Prof. Doutor José Cabeda

46 Detecção de IFN-g por citometria
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Ensaios Moleculares Prof. Doutor José Cabeda