Fraccionamento celular e cultura de células

Apresentação em tema: "Fraccionamento celular e cultura de células"— Transcrição da apresentação:

1 Fraccionamento celular e cultura de células

2 Células do SI (vulgarmente isoladas)
Eritrócitos Plaquetas Polimorfonucleados (PMNs) Macrófagos NK Linfócitos B e T - imunidade humoral e celular

3 Separação de células sanguíneas Centrifugação em gradiente
Envolve a separação de partículas com base na sua massa e forma numa solução de densidade e/ou concentração decrescente A amostra é colocada no cimo do tubo e durante a centrifugação migra de acordo com a sua velocidade e sedimentação, ex: gradiente de Ficoll-Hypaque

4 Separação de células sanguíneas Centrifugação em gradiente
Eritrócitos+ PMNs - mais densos Células mononucleares (linfócitos/ monócitos)-menos densos: recuperados à superfície

5 Separação de células sanguíneas Centrifugação em gradiente Análises Clínicas (Linfócitos)
Colheita + Heparina Decantar sobre tubo com um gradiente de Ficoll- Hypaque. O gradiente é formado por uma mistura de soluções de concentrações progressivamente crescentes que se distribuem ao longo do tubo de centrífuga, ficando as soluções de maior densidade no fundo Coloca-se a amostra de sangue heparinizado sobre o gradiente e centrifuga-se. As células distribuem-se em camadas distintas ao longo do gradiente, de acordo com a sua densidade.

6 Análises Clínicas (Linfócitos)
O Ficoll possui uma densidade maior que a dos linfócitos mas menor que os glóbulos vermelhos e granulócitos; após centrifugação os glóbulos vermelhos e os PMNs passam pelo Ficoll formando um pellet no fim do tubo. Os linfócitos ficam na interface do meio e do Ficoll A camada correspondente aos linfócitos e algumas células mononucleares- anel branco - pode ser aspirada.

7 Separação de células sanguíneas Panning
Aderência celular a uma superfície sólida

8 Separação de linfócitos por Panning Análises Clínicas (Linfócitos)
Técnica usada no isolamento de subpopulações de linfócitos, em que estes podem aderir á superfície se esta estiver coberta com os anticorpos apropriados Método eficaz na separação Th de Tc usando anticorpos CD4+ e CD8+ Eficaz também na separação de linfócitos T e B usando anti-Igs

9 Separação de células sanguíneas Separação imunomagnética
Acoplamento de esferas magnéticas a anticorpos monoclonais que reconhecem moléculas da superfície das células Os anticorpos acoplados ás esferas magnéticas, são misturados com as células a separar;a mistura passa por uma coluna magnética, que retêm as células ligadas ao anticorpo.

10 Separação de células sanguíneas Separação imunomagnética

11 Separação de células sanguíneas (Linfócitos, ...................)
Centrifugação Panning Separação imunomagnética Cromatografia de afinidade Citometria de Fluxo FACS ( fluorescence- activated cell sorter)

12 Separação de células sanguíneas (Linfócitos, ...................)
O isolamento de de linfócitos é um passo fundamental na avaliação qualitativa e quantitativa da imunidade celular Em análises clínicas estes estudos centram-se na caracterização de defeitos primários ou adquiridos da imunidade: quantitativamente podemos totalizar e diferenciar o nº de células representantes das populações linfocitárias qualitativamente podemos caracterizar funcionalmente estas células e avaliar a sua capacidade efectora

13 CULTURA DE CÉLULAS

14 APLICAÇÕES Estudos imunológicos Resposta celular in vitro
Migração celular Estudos de sensibilidade a drogas Citotoxicidade Adesão celular Proliferação celular

15 Meio de cultura apropriado: - Factores de crescimento
Requisitos das culturas celulares  Como se processa? É necessário mimetizar as condições fisiológicas Meio de cultura apropriado: - Soro e nutrientes - Factores de crescimento Antibióticos Atmosfera adequada Superfície de adesão

16 Meio de cultura apropriado
SORO e NUTRIENTES Soro, a parte não celular do sangue, contém centenas de proteínas e factores necessários ao crescimento celular: - Insulina, Transferrina e Proteínas transportadoras de ferro; Vitaminas Biotina, Folatos, Tiamina, riboflavina, ácido pantoténico,etc Sais NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2 Glucose Exs de meios comerciais : PBS,DMEM,RPMI,Iscove`s

17 Ponto de partida para linhas celulares contínuas
Culturas primárias Derivam directamente dos tecidos ou orgãos (pele, rim, fígado) Estes devem ser obtidos em condições assépticas e levados ao laboratório rapidamente, imersos em meio de cultura, para manutenção da viabilidade celular. Ponto de partida para linhas celulares contínuas resultam da selecção, de culturas primárias, de clones capazes de sobreviver e de se multiplicar (50 gerações) estes clones (qq população de células descendentes de uma célula única ancestral) originam linhas celulares diplóides ou aneuplóides

18 Linhas Celulares Imortais
Têm origem em células tumorais, que sofreram transformações oncogénicas. Não só crescem indefinidamente em cultura, mas também o fazem máis rapidamente, duplicando o seu nº em menos de 24 horas. Apesar da sua proveniência tumoral mantem as propriedades básicas celulares, o que permite ao imunologista a transferência de genes no intuito de investigar a sua função e regulação. Ex: Infecção por vírus - HTLV-1 - para células T - EBV - para células B