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INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO Dayse Locateli 2005.

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Apresentação em tema: "INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO Dayse Locateli 2005."— Transcrição da apresentação:

1 INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO Dayse Locateli 2005

2 Ligações não covalentes: Pontes de Hidrogênio Ligações iônicas Interações hidrofóbicas Interações de Van der Waals Interação reversível Complementariedade Especificidade

3 Afinidade Força de interação entre um único sítio de ligação Ag-Ac (em um único epítopo). Avidez Força de interações total entre Ac e Ag. Soma das afinidades de todos epítopos envolvidos Reação cruzada Dois Ag diferentes apresentam um epítopo idêntico Ac específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não relacionado, mas com propriedades químicas similares.

4 Pesquisa Diagnóstico Soroepidemiológia Métodos: Precipitação Aglutinação Imunoensaios Aplicações

5 Metodologias que utilizam: 1)Reagentes não marcados Reação de precipitação Reação de aglutinação 2) Reagentes marcados RIA ELISA Imunofluorescência Western Blot

6 Reagentes não marcados Detectam / quantificam as conseqüências da ligação Ag – Ac

7 Interação: ac - ag solúvel forma uma rede que pode desenvolver um precipitado visível. Anticorpos bivalentes + Antígenos multivalentes Reação de Precipitação PRECIPITADO

8 1- Reação de precipitação em soluções Reação quantitativa: Qtidade cte Ac Qtidade cresc. Ag Qtidade precipitina

9 2 - Reação de Precipitação em gel Utiliza uma matriz de ágar Ag + Ac = linha de precipitação visível a) Imunodifusão radial (Método de Mancini) Ag ou Ac fixos Dosagem de proteínas séricas b) Imunodifusão dupla Identidade de Ags = Ac de reatividade conhecida

10 Reações de Aglutinação Ac + Ag particulado aglutininas Agregação visível de partículas Efeito pró-zona Eritrócitos Bactérias Fungos látex

11 Aglutinação Direta Tipagem ABO Testes confirmatórios para sífilis Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação Detecção Acs específicos Quantificação Aglutinação bacteriana Presença de infecção Diferenciação de espécies

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13 Aglutinação passiva Ag solúveis associados a outras superfícies (Partículas de látex ou superfície de hemácias) +

14 Inibição da Aglutinação

15 Reagentes Marcados Detectam / quantificam diretamente a ligação Ag - Ac

16 Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA substrato (incolor) Qualitativos Quantitativos Direto = Ag Indireto = Ac Ac marcados com Enzimas + + = COR Ag Fosfatase alcalina Peroxidase B-galactosidase

17 ELISA Indireto ELISA Direto ou Sanduíche

18 ELISA Competitivo Aplicações do ELISA: Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa Vantagens: Teste de alta sensibilidade Permite quantificar Ag ou Ac das amostras Seguros e de baixo custo

19 Imunofluorescência

20 luz Ac + fluorocromo Ac + Fluorocromo r ght

21 IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA Reagentes secundários: Anticorpo secundário marcado com fluorocromo proteína A marcada com fluorocromo = porção Fc das IgGs

22 Isotiocianato de fluoresceína (FITC) VERDE Ficoeritrina (FE) VERMELHA

23 Aplicações: Identificar subpopulações de linfócitos Identificar espécies bacterianas localização de hormônios Detecção complexos ag-ac em doenças auto-imunes Detecção anticorpos anti-DNA Teste qualitativo Fc

24 Citometria de Fluxo Separação de células ativadas por fluorescência Anticorpos contra moléculas de membrana ou Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD) Cada Ac é marcado com um fluorocromo diferente Teste qualitativo e quantitativo CD 4 CD 18 CD 125 CD 147

25 Tamanho Granulosidade Fluorescência

26 CD4 CD8 CD20 Aplicações: Determinar o tipo e n o de céls. sanguíneas brancas isolar populações celulares distribuição de céls de acordo com a densidade dos Ag o tamanho celular. Uso de múltiplos anticorpos fluorescentes HIV, Leucemias

27 Western Blotting Eletroforese de proteínas Diferença de tamanho (PM) Mobilidade da proteína Detecção Ag ou Ac

28 Western Blotting Gel membrana de transferência papel filtro preenchimento tela de suporte Gel/ membrana/ filtro Tampão ( +) ( - ) Separação e detecção de proteínas Identificação de Ac específico Ac radiomarcado ou Ac sec. ligado a enzima

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30 Radioimunoensaio RIA Hormônio proteínas séricas drogas vitaminas Ac 0,0001 microgramas/ mL Moléculas marcadas com ISÓTOPO

31 Marcações: –I 125 : emite raios gama –H 3 : raios beta Aplicações: Testes que necessitem de alta sensibilidade Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue Pesquisa Desvantagem: Não é um teste seguro!

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