INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO

Apresentação em tema: "INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO"— Transcrição da apresentação:

1 INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO
Detecção, quantificação e caracterização dos anticorpos e seu uso como ferramenta para pesquisa e diagnóstico

2 RESPOSTA DE ANTICORPOS
Especificidade Habilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag. Quantidade N° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua produção. Isotipo Determina a persistência (meia vida in vivo diferente). A composição determina a função dos Ac e os locais onde são encontrados. Afinidade Força de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário. Avidez: força total de ligação, nos dois sítios.

3 Avidez x Afinidade

4 INTERAÇÕES Reações reversíveis. Ligações não covalentes:
Pontes de hidrogênio Interações hidrofóbicas Interações de Van der Waals Ligações iônicas

5 MÉTODOS Reagentes não marcados Reação de precipitação
Reação de aglutinação 2) Reagentes marcados RIA ELISA Imunofluorescência Western Blotting

6 MÉTODOS PRECIPITAÇÃO APLICAÇÕES AGLUTINAÇÃO IMUNOENSAIOS - Pesquisa
- Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial - Imunoeletroforese AGLUTINAÇÃO - Aglutinação direta e indireta - Inibição da aglutinação - Teste de Coombs IMUNOENSAIOS - RIA - ELISA - Imunofluorescência e Citometria de Fluxo Western Blotting APLICAÇÕES - Pesquisa - Diagnóstico - Soroepidemiologia

7 PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
Formação de complexos Ag/Ac. Aglutinação: É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes. As reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e particulado.

8 REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
Interação entre Ac e Ag solúvel Ac precisa ser bivalente Ag precisa ser bi ou polivalente A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação que cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA PRECIPITADO

9 É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes concentrações dos mesmos. Observe abaixo: Zona de excesso de anticorpo Zona de equivalência de antígeno + - Anticorpo livre Antígeno livre 100%-- Percentual de complexo imune precipitado Quantidade de antígeno adicionado

10 TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL
IMUNODIFUSÃO Coloca-se agarose sobre uma lâmina: Imunodifusão Dupla: Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo: Ac

11 IMUNODIFUSÃO DUPLA As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação: Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante Ac Ag 11 Utilização: muito usada em pesquisa e diagnóstico de algumas doenças, como cisticercose

12 Poços onde são colocados padrões e amostras a serem dosados
IMUNODIFUSÃO RADIAL Permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo. O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitando-se em um anel (halo) em torno do orifício. Poços onde são colocados padrões e amostras a serem dosados Agarose contendo anticorpos anti-IgG humana Halo de precipitação IgG – anti-IgG Utilização: dosagem de IgG, IgA e IgM e proteínas séricas.

13 IMUNOELETROFORESE Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica. As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas. Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. Ag e Ac formam arcos de precipitação. + - Ag 1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna canaleta 2- Anti-soro na canaleta 3- Difusão e precipitação 13

14 REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
Ac + Ag multivalente particulado Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-quantitativo) Pó-zona: excesso de Ac Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga elétrica (repulsão) Agregação visível de partículas = Eritrócitos, bactérias, fungos e látex

15 AGLUTINAÇÃO DIRETA Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação
Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO) Células ou partículas insolúveis Ac = Aglutinação 1) Amostra de sangue na placa teste: 2) Reagente (anticorpo anti A, B): 15

16 AGLUTINAÇÃO DIRETA 4) Mistura-se: 3) Controle negativo: 16

17 AGLUTINAÇÃO DIRETA 5) Leitura do resultado:
negativo positivo Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima. 17

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19 AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)
Ag solúveis associados a outras superfícies (Partículas de látex ou superfície de hemácias) Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas: As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa. O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa. Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço. Aglutinação Positiva Negativa

20 Partículas revestidas com hCG
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez) Resultado negativo: (ausência de hCG na urina). Ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG. + Soro anti - hCG Urina São incubados e colocados numa placa Adicionam-se Partículas revestidas com hCG Resultado positivo: (presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação. Ac se ligaram no hCG da urina, (ficando bloqueados), na incubação inicial 20

21 TESTE DE COOMBS Ac antiimunoglobulinas (Robert Coombs);
DHRN – mãe produz IgG anti-Rh; Não aglutinam os eritrócitos; Direto: Ac ligados aos eritrócitos fetais; Indireto: Ac anti-Rh não aglutinantes no soro materno. Permite detectar incompatibilidades Rh, prevenindo contra DHRN.

22 IMUNOENSAIOS Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos, isótopos)
Tipos: RIA ELISA IFA / CITOMETRIA DE FLUXO WESTERN BLOTTING

23 IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
Princípio da técnica: Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível. Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa. A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de fluorescência). Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos: direta, indireta ou saduíche.

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25 fluorescência emitida chega ao observador luz UV atinge o ma-
Microscópio de fluorescência com epiluminação fluorescência emitida chega ao observador luz UV atinge o ma- terial examinado

26 TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

27 APLICAÇÃO DA TÉCNICA IFA direta:
Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais. IFA indireta: Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes. É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é mais intensa) e especificidade.

28 IMAGENS

29 CITOMETRIA DE FLUXO Ferramenta que detecta e quantifica células individuais passando em uma corrente através de um feixe de Laser. Separa as células por fluorescência ativada. Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente. É um teste qualitativo e quantitativo. APLICAÇÕES Tipo de linfócitos; Quantidade, tamanho, granulosidade; Isolamento de populações celulares; HIV

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31 Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA
O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas. O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora). A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através de leitura em fotocolorímetro. Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e captura. Fosfatase alcalina Peroxidase B-galactosidase

32 TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto
DIRETO OU SANDUÍCHE INDIRETO PLACA UTILIZADA

33 ELISA Indireto ELISA Direto ou Sanduíche

34 ELISA Competitivo Aplicações do ELISA:
Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa Vantagens: Teste de alta sensibilidade Permite quantificar Ag ou Ac das amostras Seguros e de baixo custo

35 RADIOIMUNOENSAIO - RIA
Marcações: I125: emite raios gama H3: raios beta Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g) Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo. Aplicações: Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios, proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa

36 WESTERN BLOTTING Eletroforese de proteínas.
Identifica antígenos ou anticorpos.

37 WESTERN BLOTTING

38 WESTERN BLOTTING

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