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INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO Detecção, quantificação e caracterização dos anticorpos e seu uso como ferramenta para pesquisa e diagnóstico.

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1 INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO Detecção, quantificação e caracterização dos anticorpos e seu uso como ferramenta para pesquisa e diagnóstico

2 RESPOSTA DE ANTICORPOS Especificidade Habilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag. Quantidade N° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua produção. Isotipo Determina a persistência (meia vida in vivo diferente). A composição determina a função dos Ac e os locais onde são encontrados. Afinidade Afinidade Força de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário. Avidez: Avidez: força total de ligação, nos dois sítios.

3 Avidez x Afinidade

4 INTERAÇÕES Reações reversíveis Reações reversíveis. Ligações não covalentes: - Pontes de hidrogênio - Interações hidrofóbicas - Interações de Van der Waals - Ligações iônicas

5 MÉTODOS 1)Reagentes não marcados Reação de precipitação Reação de aglutinação 2) Reagentes marcados RIA ELISA Imunofluorescência Western Blotting

6 MÉTODOS PRECIPITAÇÃO PRECIPITAÇÃO - Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial - Imunoeletroforese AGLUTINAÇÃO AGLUTINAÇÃO - Aglutinação direta e indireta - Inibição da aglutinação - Teste de Coombs IMUNOENSAIOS IMUNOENSAIOS - RIA - ELISA - Imunofluorescência e Citometria de Fluxo - Western Blotting APLICAÇÕES - - Pesquisa - Diagnóstico - Soroepidemiologia

7 PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO Precipitação: Precipitação: Formação de complexos Ag/Ac. Aglutinação: Aglutinação: É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes. As reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e particulado.

8 REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO Interação entre Ac e Ag solúvel Ac precisa ser bivalente Ag precisa ser bi ou polivalente A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação que cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA PRECIPITADO

9 É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes concentrações dos mesmos. Observe abaixo: Zona de excesso de anticorpo Zona de equivalência Zona de excesso de antígeno Anticorpo livre Antígeno livre 100%-- Percentual de complexo imune precipitado Quantidade de antígeno adicionado

10 TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL IMUNODIFUSÃO Coloca-se agarose sobre uma lâmina: Imunodifusão Dupla: Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo : Ac

11 IMUNODIFUSÃO DUPLA Ac Ag Ac Ag 11 Ac Ag Utilização: muito usada em pesquisa e diagnóstico de algumas doenças, como cisticercose As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação: Pode ser visualizada pós lavagem do gel, para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante

12 Permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo. O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitando- se em um anel (halo) em torno do orifício. IMUNODIFUSÃO RADIAL Poços onde são colocados padrões e amostras a serem dosados Agarose contendo anticorpos anti-IgG humana Halo de precipitação IgG – anti-IgG Utilização: dosagem de IgG, IgA e IgM e proteínas séricas.

13 Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica. As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas. Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. Ag e Ac formam arcos de precipitação. IMUNOELETROFORESE Ag 1- Separação de antígenos2- Anti-soro na coluna canaleta 2- Anti-soro na canaleta canaleta 3- Difusão e precipitação

14 Ac + Ag multivalente particulado Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-quantitativo) Pó-zona: excesso de Ac Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga elétrica (repulsão) Agregação visível de partículas = Eritrócitos, bactérias, fungos e látex REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO

15 15 2) Reagente (anticorpo anti A, B): AGLUTINAÇÃO DIRETA 1) Amostra de sangue na placa teste: Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO) Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação

16 16 3) Controle negativo: 4) Mistura-se: AGLUTINAÇÃO DIRETA

17 17 5) Leitura do resultado: Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima. negativo positivo AGLUTINAÇÃO DIRETA

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19 AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA) Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas: As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa. O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa. Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço. Aglutinação Positiva Negativa Ag solúveis associados a outras superfícies (Partículas de látex ou superfície de hemácias)

20 20 Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez) INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO + Soro anti - hCG Urina São incubados e colocados numa placa Adicionam-se Partículas revestidas com hCG Resultado positivo: (presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação. Ac se ligaram no hCG da urina, (ficando bloqueados), na incubação inicial Resultado negativo: (ausência de hCG na urina). Ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG.

21 TESTE DE COOMBS Ac antiimunoglobulinas (Robert Coombs); DHRN – mãe produz IgG anti-Rh; Não aglutinam os eritrócitos; Direto: Ac ligados aos eritrócitos fetais; Indireto: Ac anti-Rh não aglutinantes no soro materno. Permite detectar incompatibilidades Rh, prevenindo contra DHRN.

22 Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos, isótopos) Tipos: - RIA - ELISA - IFA / CITOMETRIA DE FLUXO - WESTERN BLOTTING IMUNOENSAIOS

23 Princípio da técnica: Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível. Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa. A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de fluorescência). Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos: direta, indireta ou saduíche. IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)

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25 Microscópio de fluorescência com epiluminação luz UV atinge o ma- terial examinado fluorescência emitida chega ao observador

26 TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

27 IFA direta: Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais. IFA indireta: Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto- imunes. É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é mais intensa) e especificidade. APLICAÇÃO DA TÉCNICA

28 IMAGENS

29 Ferramenta que detecta e quantifica células individuais passando em uma corrente através de um feixe de Laser. Separa as células por fluorescência ativada. Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente. É um teste qualitativo e quantitativo. APLICAÇÕES Tipo de linfócitos; Quantidade, tamanho, granulosidade; Isolamento de populações celulares; HIV CITOMETRIA DE FLUXO

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31 Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas. O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora). A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através de leitura em fotocolorímetro. Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e captura. Fosfatase alcalina Peroxidase B-galactosidase

32 TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto DIRETO OU SANDUÍCHE INDIRETO PLACA UTILIZADA

33 ELISA Indireto ELISA Direto ou Sanduíche

34 Aplicações do ELISA: Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa Vantagens: Teste de alta sensibilidade Permite quantificar Ag ou Ac das amostras Seguros e de baixo custo ELISA Competitivo

35 RADIOIMUNOENSAIO - RIA Marcações: I 125 : emite raios gama H 3 : raios beta Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g) Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo. Aplicações: Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios, proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa

36 WESTERN BLOTTING Eletroforese de proteínas. Identifica antígenos ou anticorpos.

37 WESTERN BLOTTING

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