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MÉTODOS LABORATORIAIS UTILIZANDO ANTICORPOS. 1- INTRODUÇÃO POR QUE UTILIZAR ANTICORPOS? QUAIS AS CARACTERÍSTICAS BÁSICAS E FUNDAMENTOS DOS ENSAIOS QUE.

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1 MÉTODOS LABORATORIAIS UTILIZANDO ANTICORPOS

2 1- INTRODUÇÃO POR QUE UTILIZAR ANTICORPOS? QUAIS AS CARACTERÍSTICAS BÁSICAS E FUNDAMENTOS DOS ENSAIOS QUE UTILIZAM ANTICORPOS?

3 1- INTRODUÇÃO 1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas: -Especificidade -Diversidade -Memória -Especialização -Autolimitação -Não reatividade ao próprio

4 1- INTRODUÇÃO 1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas: -Especificidade – conferida por duas moléculas principais: - TCR – presente na membrana de linfócitos; - Anticorpos – produzidos por linfócitos B, presentes na membrana de linfócitos B e na forma secretada, solubilizados em diversos fluidos corporais.

5 1- INTRODUÇÃO 1.2- Principais isotipos de anticorpos -IgM -IgG -IgA -IgE -IgD

6 1- INTRODUÇÃO 1.2- Principais isotipos de anticorpos: -IgM -IgG – encontrado em maior concentração no soro, de obtenção mais fácil, sofre maturação de afinidade -IgA -IgE -IgD

7 1- INTRODUÇÃO 1.3- Principais características dos Ensaios que utilizam Anticorpos: -Especificidade: Característica que indica que o teste em questão identificará somente o antígeno ou o anticorpo desejado. -Quanto MAIOR a especificidade, MENOR a ocorrência de resultados falsos-positivos, MENOR a ocorrência de reações cruzadas. - Dependente do tipo de anticorpo e antígeno empregado no teste, e do sistema de detecção da interação Ag-Ac.

8 1- INTRODUÇÃO 1.3- Principais características dos Ensaios que utilizam Anticorpos: -Sensibilidade: Característica inerente ao método estreitamente relacionada com a quantidade mínima de antígeno ou anticorpo que poderá ser detectada -Estreitamente ligada ao sistema de amplificação e detecção da interação Ag-Ac. -Métodos enzimáticos, radioativos, fluorescentes, quimioluminescentes.

9 1- INTRODUÇÃO 1.4- Fatores a serem analisados na escolha do método: -Sensibilidade; -Especificidade (confiabilidade de resultados); -Custo; -Disponibilidade de material; -Segurança; -Aplicabilidade à amostra disponível, Ag/Ac a ser detectado e espécie animal a ser analisada; -Tempo de realização do método.

10 1- INTRODUÇÃO 1.5 – Aplicações dos métodos: - Identificação e/ou quantificação de moléculas específicas em fluidos biológicos; -Purificação de proteínas; -Diagnóstico de doenças auto-imunes, infecciosas e hipersensibilidades; -Identificação de genes e seus produtos; -Localização de moléculas específicas em células e tecidos.

11 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

12 2.1 - Imunoaglutinação/Imunoprecipitação: Primeiros testes a serem desenvolvidos: - Realizados em meio líquido; - Exigem alta quantidade de Ac/Ag para sua realização – Baixa Especificidade; - Não possuem metodologias eficazes para a detecção da interação Ag/Ac – Baixa Sensibilidade.

13 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.2- Imunodifusão: Interação Ag/Ac realizada em meio sólido (gél de ágar). - Diversos tipos: - Imunodifusão Radial Simples - Ag ou Ac imobilizado no gel – Migração do Ag ou Ac da solução teste no gel, até atingir região de concentração equivalente; - Imunodifusão Dupla e Outcherlony – Ambos Ag e Ac migram no gel, formação de banda na região de equivalência.

14 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

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19 2.4- Fixação do Complemento: Variação da técnica de Hemoaglutinação, onde utiliza-se a capacidade citolíca do Sistema de Complemento para amplificar a detecção da interação Ag/Ac. -Variações da técnica: Inibição da Fixação do Complemento.

20 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.4- Fixação do Complemento:

21 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.4- Fixação do Complemento: -Vantagens: Maior sensibilidade do que a Hemoaglutinação, rápida execução, baixo custo; -Desvantagens: Devido a problemas na preservação do Complemento, e na sua estabilidade, problemas de falso negativos podem ocorrer.

22 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.5- ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) – Técnica que utiliza Ag/Ac imobilizado em placa de polímero de carbono, e anticorpo conjugado a uma enzima, a qual, após agir sobre seu substrato em presença de substância cromógena, amplificará a detecção da interação Ag/Ac através da formação de cor; -Variações da Técnica: ELISA Quimioluminescente, ELISA Fluorescente, ELISA Radioativo

23 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.5- ELISA: Sanduíche Competição

24 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS ELISA Indireto:

25 Outros componentes do soro ELISA SANDWICH Antígeno a ser dosadoAnticorpo primário Anticorpo conjugado TMB Enzima Peroxidase

26 ELISA DE COMPETIÇÃO Outros componentes do soro Antígeno a ser dosadoAnticorpo primário Antígeno biotinilado TMB ST-AV- Peroxidase

27 ELISA DE CAPTURA Anticorpo anti-IgM IgM a ser detectada IgM inespecífica Antígeno biotinilado TMB ST-AV- Peroxidase

28 ELISA INDIRETA Antígeno purificado IgM a ser detectada IgM inespecífica Anticorpo conjugado TMB

29 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS Quantificação de Ag/Ac em ELISA:

30 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.5- ELISA: - Vantagens: Método altamente sensível e específico, com alto grau de confiabilidade como ensaio quantitativo, custo baixo a médio. - Desvantagens: Devido a alta sensibilidade, pequenas variações de pipetagem e tempo de incubação podem ocasionar resultados alterados; em extratos de antígenos, não se pode precisar a qual antígeno houve a resposta; ELISA de competição muito susceptível a erros de manipulação.

31 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica: Utilizados para detecção e localização de antígenos em células e tecidos e para detecção de anticorpos específicos em fluidos biológicos. - Métodos de alta especificidade e alta especificidade - Utilização de anticorpos conjugados com substâncias fluorescentes (FITC, FAC) na IFA, e de anticorpos conjugados com enzimas (Imunohistoquímica).

32 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica:

33 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica: - Vantagens: Alta especificidade e sensibilidade; possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização, bem como do tráfico intracelular. -- Desvantagens: variação individual na leitura de resultados de IFA; alto custo de microscópio de fluorescência; técnicas especiais de fixação e inclusão de tecidos para Imunohistoquímica nem sempre disponíveis.

34 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.7- Western-Blot: Associação de técnica de Eletroforese em Gel de SDS-PAGE com técnicas imunológicas - Permite a identificação do reconhecimento de antígenos com peso molecular definido - Identificação de anticorpos que reconhecem determinado antígeno em solução contendo diversos antígenos - Permite a realização de cinética de expressão de proteínas celulares.

35 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.7- Western-Blot:

36 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.7- Western-Blot:

37 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.7- Western-Blot: - Vantagens: alta sensibilidade e especificidade; reconhecimento de antígenos individuais em um extrato; realização de perfil de reconhecimento de antígenos e determinação de proteínas imunodominantes; - Desvantagens: Custo médio a alto; procedimento longo e propenso a erros em diversos pontos; dependendo do sistema de revelação, pode-se ter problemas de segurança.

38 3- BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA - Imunologia Celular e Molecular. Abbul K. Abbas & Andrew H. Lichtman. Quinta Edição, Elsevier Editora - Imunologia Médica. Abba I. Terr, Daniel P. Sittes & Tristam. Décima Edição. Guanabara Koogan Editora. - Imunologia Veterinária. Ian R. Tizard. Quinta Edição. Roca Editora. - Imunologia. David Male, Ivan Roitt & Jonathan Brostoff. Sexta Edição. Manole Editora. - Imunobiologia: O Sistema Imune na Saúde e na Doença. Charles Janeway, Paul Travers & Mark Walport & J. Donald Capra. Quinta Edição. Artmed Editora. -Immunodiagnostics, A Practical Approach. Ray Edwards. Oxford University Press. -Antibodies, A Laboratory Manual. Ed Harlow & David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory Press.


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