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Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Microscopia Imunohistoquimica Microscopia de Fluorescência.

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Apresentação em tema: "Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Microscopia Imunohistoquimica Microscopia de Fluorescência."— Transcrição da apresentação:

1 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Microscopia Imunohistoquimica Microscopia de Fluorescência

2 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Processamento de amostras Amostras fixadas Fixação Fixação Parafinação Parafinação Armazenamento RT Armazenamento RT Preparar lâmina (silano, etc) Preparar lâmina (silano, etc) Cortar 4-6 m Cortar 4-6 m Retirar parafina Retirar parafina Rehidratar Rehidratar Recuperar Ag Recuperar Ag marcar marcar Amostras Congeladas Retirar gordura e tecido conectivo Retirar gordura e tecido conectivo 1.5 cm 2 x 0.5 cm 1.5 cm 2 x 0.5 cm Transportar em MEM/RPMI 4ºC Transportar em MEM/RPMI 4ºC Embeber (até 1 h pós colheita) Embeber (até 1 h pós colheita) Armazenar –70ºC Armazenar –70ºC Preparar Lâmina Preparar Lâmina Cortar 4-5 m Cortar 4-5 m Fixar com paraformaldeido a 1% Fixar com paraformaldeido a 1% marcar marcar

3 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Corte de tecidos

4 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Fixação Formaldeído Formaldeído Método de eleição Método de eleição Mecanismo preciso desconhecido, mas envolve crosslinking Mecanismo preciso desconhecido, mas envolve crosslinking Utiliza-se habitualmente Formaldeído 3.7% pH neutro Utiliza-se habitualmente Formaldeído 3.7% pH neutro Responsável por epitope masking Responsável por epitope masking Amostras com cerca de 1.0 x 1.0 x 0.3 cm colocadas numa cassete e imersas em 20 volumes de fixador por 12 a 24 h Amostras com cerca de 1.0 x 1.0 x 0.3 cm colocadas numa cassete e imersas em 20 volumes de fixador por 12 a 24 h Transferir para Et-oh 70% até processar Transferir para Et-oh 70% até processar Alcool Alcool Muito menos utilizado Muito menos utilizado

5 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Congelação Remover excesso de MEM/RPMI tocando em papel Remover excesso de MEM/RPMI tocando em papel Embeber em O.C.T. em molde Embeber em O.C.T. em molde Congelar durante 20 a 30 segundos em Congelar durante 20 a 30 segundos em banho de isopentano arrefecido com banho de isopentano arrefecido com Azoto liquido (-135 a -140ºC) Azoto liquido (-135 a -140ºC) Gelo seco (-30ºC) Gelo seco (-30ºC) Banho de congelação de tecidos (-52ºC) Banho de congelação de tecidos (-52ºC) Remover excesso de O.C.T. Com bisturi Remover excesso de O.C.T. Com bisturi Congelar a –70ºC / -80ºC Congelar a –70ºC / -80ºC

6 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Recuperação de Antigénios Aumenta a sensibilidade da imunohistoquimica Aumenta a sensibilidade da imunohistoquimica Reverte parcialmente o mascarar de Ag devido à fixação Reverte parcialmente o mascarar de Ag devido à fixação Mecanismo preciso não é conhecido mas envolve a quebra de crosslinks entre proteínas envolvendo ou não Ca 2+ Mecanismo preciso não é conhecido mas envolve a quebra de crosslinks entre proteínas envolvendo ou não Ca 2+ Envolve habitualmente a utilização de calor( 100ºC) durante 20 min. Envolve habitualmente a utilização de calor( 100ºC) durante 20 min. Soluções: Soluções: 10 mM Tampão citrato pH 3 a 6 10 mM Tampão citrato pH 3 a mM Tris-Cl pH 8 a 10 com/sem ureia 100 mM Tris-Cl pH 8 a 10 com/sem ureia 1 mM EDTA pH mM EDTA pH 8.0 Eficiente p/ nucleo Eficiente p/ nucleo Causa background por recuperação biotina endógena Causa background por recuperação biotina endógena

7 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Tecidos control Não existem tecidos standard para control Não existem tecidos standard para control Tecidos control devem ser processados da mesma forma que os tecidos teste Tecidos control devem ser processados da mesma forma que os tecidos teste Em aparelhos automáticos, os tecidos control devem estar na mesma lâmina que o teste Em aparelhos automáticos, os tecidos control devem estar na mesma lâmina que o teste

8 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Optimização da marcação Diluição do anticorpo primário Diluição do anticorpo primário [] sensibilidade mas tb R.inespecíficas [] sensibilidade mas tb R.inespecíficas Tempo de marcação do primário Tempo de marcação do primário Tipo e concentração do secundário Tipo e concentração do secundário Tampão de recuperação de Ag Tampão de recuperação de Ag Utilização de EDTA Utilização de EDTA Melhora marcação com alguns Ag Melhora marcação com alguns Ag força um passo de bloqueio de biotina endógena força um passo de bloqueio de biotina endógena Temperatura de incubação Temperatura de incubação Utilização de sistemas automáticos limita a escolha Utilização de sistemas automáticos limita a escolha Gama de temperaturas limitada Gama de temperaturas limitada Anticorpos secundários e reagentes de detecção optimizados Anticorpos secundários e reagentes de detecção optimizados Tempos de incubação devem ser compatíveis entre os vários protocolos Tempos de incubação devem ser compatíveis entre os vários protocolos

9 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Sistemas de detecção (I) Maioritáriamente baseados em Maioritáriamente baseados em horseradish peroxidase (preferida nos marcadores automáticos) horseradish peroxidase (preferida nos marcadores automáticos) Fosfatase alcalina Fosfatase alcalina 3 passos 3 passos PAP (peroxidade anti-peroxidase) PAP (peroxidade anti-peroxidase) LSAB (enzyme labelled streptavidin biotin) LSAB (enzyme labelled streptavidin biotin) ABC (Avidin biotin complex) ABC (Avidin biotin complex)

10 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Sistemas de detecção (II) 2 passos 2 passos Menos sensíveis Menos sensíveis Recentemente introduzidos os polímeros de dextran com cerca de 100 moléculas de enzima Recentemente introduzidos os polímeros de dextran com cerca de 100 moléculas de enzima sensibilidade semelhante aos métodos com 3 passos sensibilidade semelhante aos métodos com 3 passos não envolve biotina, pelo que não exige o bloqueio da biotina endógena não envolve biotina, pelo que não exige o bloqueio da biotina endógena

11 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Sistemas de detecção (III) 5 passos (Extremamente sensíveis, mas inespecificidade pode ser problemática) 5 passos (Extremamente sensíveis, mas inespecificidade pode ser problemática) primário; primário; sec.-biotina; sec.-biotina; ABC-peroxidase;biotinil-tiramida+H2O2; ABC-peroxidase;biotinil-tiramida+H2O2; Peroxidase+H2O2 geram radicais livres que activam a biotinil- tiramida, a qual se liga então covalentemente a grupos amino disponíveis na vizinhança, gerando um tapete de biotina Peroxidase+H2O2 geram radicais livres que activam a biotinil- tiramida, a qual se liga então covalentemente a grupos amino disponíveis na vizinhança, gerando um tapete de biotina Peroxidase-estreptavidina Peroxidase-estreptavidina A estreptavidina liga-se ao tapete de biotina na vizinhança do anticorpo, revestindo-o com peroxidase A estreptavidina liga-se ao tapete de biotina na vizinhança do anticorpo, revestindo-o com peroxidase Cromogénio Cromogénio

12 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Sistemas de detecção (IV) Cromogénio Cromogénio Peroxidase Peroxidase 3,3-Diaminobenzidina (DAB) –castanho 3,3-Diaminobenzidina (DAB) –castanho 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) – vermelho 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) – vermelho Fosfatase alcalina Fosfatase alcalina 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato nitrobluo (BCIP/NBT) – purpura 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato nitrobluo (BCIP/NBT) – purpura Fast-red-naphtol (AS-TR) – vermelho Fast-red-naphtol (AS-TR) – vermelho Escolha depende de Escolha depende de Contrastante (hematoxilina ou verde de metilo) Contrastante (hematoxilina ou verde de metilo) Tempo de incubação (DAB mais rápido que AST-TR) Tempo de incubação (DAB mais rápido que AST-TR) Segurança (DAB é carcinogénio) Segurança (DAB é carcinogénio) Duração (DAB origina marcação permanente) Duração (DAB origina marcação permanente) Contraste (AEC origina um excelente contraste) Contraste (AEC origina um excelente contraste)

13 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Sistemas de detecção (V)

14 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Imunohistoquímica -Utilidade

15 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Imunofluorescência (I)

16 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Imunofluorescência (II) IgG IgM IgA IgG


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