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Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Técnicas em Imunologia Parte I Métodos Laboratoriais em Imunologia.

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1 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Técnicas em Imunologia Parte I Métodos Laboratoriais em Imunologia

2 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Colheitas Utilizar o tubo correcto Utilizar o tubo correctotubo correctotubo correcto Sangue /plasma Sangue /plasma Anticoagulante apropriado Anticoagulante apropriado EDTAEDTA CitratoCitrato heparinaheparina Soro Soro Com activador da coagulação Com activador da coagulação Com activador da coagulação e gel separador do coágulo e soro Com activador da coagulação e gel separador do coágulo e soro

3 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Soro Coagulação deve ser completa Coagulação deve ser completa Cerca de 30 a 60 minutos em tubo sem anticoagulante Cerca de 30 a 60 minutos em tubo sem anticoagulante Cerca de 15 a 30 minutos em tubo com activador da coagulação Cerca de 15 a 30 minutos em tubo com activador da coagulação Mais se o indivíduo estiver com hipocoagulação natural ou induzida Mais se o indivíduo estiver com hipocoagulação natural ou induzida Centrifugar os tubos 10 min a 1,000-1,200g-22ºC Centrifugar os tubos 10 min a 1,000-1,200g-22ºC Guardar a 4ºC excepto para CH50 e crioglobulinas Guardar a 4ºC excepto para CH50 e crioglobulinas

4 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Que tubo utilizar? Preparação de leucócitos Preparação de leucócitos Habitualmente utilizar anticoagulante (qual depende do teste) Habitualmente utilizar anticoagulante (qual depende do teste) Purificar as células Purificar as células Preservar as células Preservar as células Fenotipagem 4ºC Fenotipagem 4ºC Cultura/estudos funcionais Cultura/estudos funcionais Transportar o sangue a RT rápidamenteTransportar o sangue a RT rápidamente Preparar as células rápidamentePreparar as células rápidamente Cultivar/testar de imediatoCultivar/testar de imediato

5 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Outros tipos de Amostra (I) Urina (muito raro) Urina (muito raro) CSF CSF Saliva Saliva Liquidos de: Liquidos de: Sinovial, Sinovial, pleura, pleura, pericárdio, pericárdio, peritoneu, peritoneu, BAL BAL Utilizar Tubo c/ EDTA ou sem anticoagulante

6 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Outros tipos de Amostra (II) Biópsias (aspirados por agulha fina) Biópsias (aspirados por agulha fina) Nódulos linfáticos Nódulos linfáticos Medula óssea Medula óssea Tumores Tumores etc etc Utilizar Tubo c/ EDTA ou Com heparina

7 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Amostras que necessitam de processamento especial Complemento Complemento Congelar a –20ºC até 2 horas após colheita Congelar a –20ºC até 2 horas após colheita Crioglobulinas Crioglobulinas Colhido em tubo morno, estéril e sem anticoagulante Colhido em tubo morno, estéril e sem anticoagulante Mantido a 37ºC até ser testado Mantido a 37ºC até ser testado

8 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda O que deve acompanhar a amostra Identificação completa do doente no tubo e na requisição (ou código claro e unívoco) Identificação completa do doente no tubo e na requisição (ou código claro e unívoco) Sexo, data de nascimento Sexo, data de nascimento Exame requisitado Exame requisitado Patologia suspeita Patologia suspeita Tipo de amostra Tipo de amostra Data e hora da colheita Data e hora da colheita Nome,código e assinatura do Médico requisitante Nome,código e assinatura do Médico requisitante

9 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Razões de rejeição de amostras Colheita inapropriada Colheita inapropriada Tubo errado Tubo errado Condições de manutenção/transporte incorrectas Condições de manutenção/transporte incorrectas Informação incorrecta/ilegível no tubo Informação incorrecta/ilegível no tubo Informação no tubo discordante da requisição Informação no tubo discordante da requisição Hemólise Hemólise Volume insuficiente Volume insuficiente Amostra coagulada (em tubo com anticoagulante) Amostra coagulada (em tubo com anticoagulante)

10 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Técnicas baseadas em Imunoglobulinas Ligação dos anticorpos é específica Ligação dos anticorpos é específica Anticorpos podem ser conjugados com um vasto leque de enzimas e marcadores Anticorpos podem ser conjugados com um vasto leque de enzimas e marcadores Constituem excelentes reagentes para a identificação sensível e específica de ligandos Constituem excelentes reagentes para a identificação sensível e específica de ligandos Permitem o estudo do historial imunológico de um índivíduo Permitem o estudo do historial imunológico de um índivíduo

11 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Anticorpos como reagentes Preparação de Anticorpos policlonais Preparação de Anticorpos policlonais Inoculação/estimulação de animais Inoculação/estimulação de animais Adjuvantes Adjuvantes Que animal Que animal Que via de inoculação/estimulação Que via de inoculação/estimulação Colheita, preparação e teste do soro Colheita, preparação e teste do soro Estimulação repetida leva a uma maturação da especificidade do Ab Estimulação repetida leva a uma maturação da especificidade do Ab

12 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Anticorpos como reagentes Preparação de anticorpos monoclonais Preparação de anticorpos monoclonais Estimular animais como anteriormente Estimular animais como anteriormente Colher Linfoblastos B Colher Linfoblastos B Fazer experiências de diluição limite Fazer experiências de diluição limite Preparar hibridomas com estas células Preparar hibridomas com estas células Fazer experiências de diluição limite dos hibridomas Fazer experiências de diluição limite dos hibridomas Testar cada clone para especificidade Testar cada clone para especificidade

13 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Técnicas em Imunologia Parte I Métodos Laboratoriais em Imunologia

14 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Técnicas baseadas em imunoglobulinas Ensaios Liquídos (ensaios homogéneos) Difração da luz Difração da luz Nefelometria Nefelometria turbidimetria turbidimetria Outros ensaios liquidos Outros ensaios liquidos EMIT EMIT CEDIA CEDIA Imunofluorescência Imunofluorescência Aglutinação Aglutinação Quimioluminescência Quimioluminescência Ensaios Sólidos Ensaios Sólidos (ensaios heterogéneos) ELISA ELISA Competitivo Competitivo Não-competitivo indirecto Não-competitivo indirecto RIA RIA

15 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Técnicas baseadas na difracção da luz Nefelometria Baseada na reacção de imunoprecipitação Baseada na reacção de imunoprecipitação Mede a quantidade de luz difractada devido à presença de complexos imunológicos Mede a quantidade de luz difractada devido à presença de complexos imunológicos O ângulo de difracção e o comprimento de onda são aspectos importantes O ângulo de difracção e o comprimento de onda são aspectos importantes 31º permite melhor razão sinal/ruído 31º permite melhor razão sinal/ruídoImunoturbidimetria Baseada na reacção de imunoprecipitação Baseada na reacção de imunoprecipitação Mede a diminuição de luz que consegue atravessar uma solução na presença de complexos imunológicos Mede a diminuição de luz que consegue atravessar uma solução na presença de complexos imunológicos O detector está sempre alinhado com a fonte de luz (0º), pelo que a medida não é da luz difractada, mas da não difractada O detector está sempre alinhado com a fonte de luz (0º), pelo que a medida não é da luz difractada, mas da não difractada

16 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Curva de imunoprecipitação Assumindo: Assumindo: Ig pelo menos bivalentes IgG Ig pelo menos bivalentes IgG Antigénio com pelo menos 2 epitopes Antigénio com pelo menos 2 epitopes Se Ab em excesso, um aumento de Ag implica um aumento da reacção Se Ab em excesso, um aumento de Ag implica um aumento da reacção Se Antigénio em excesso, um aumento de antigénio diminui a probabilidade de um Ab ligar 2 antigénios, o que diminui a precipitação Se Antigénio em excesso, um aumento de antigénio diminui a probabilidade de um Ab ligar 2 antigénios, o que diminui a precipitação A quantificação só é possível se o anticorpo estiver em excesso A quantificação só é possível se o anticorpo estiver em excesso

17 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Cinética da Curva de imunoprecipitação A reacção inicia-se imediatamente, sendo visivel 20s após a adição do antigénio A reacção inicia-se imediatamente, sendo visivel 20s após a adição do antigénio A reacção prossegue de modo aproximadamente linear até que a precipitação dos complexos origina uma aparente diminuição da reacção A reacção prossegue de modo aproximadamente linear até que a precipitação dos complexos origina uma aparente diminuição da reacção

18 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Rate Nephelometry [Ab] é constante [Ab] é constante Aumento progressivo da [antigénio] Aumento progressivo da [antigénio] Deve ser realizada na zona de excesso de Ab Deve ser realizada na zona de excesso de Ab Em nefelómetros automáticos deste tipo, 2 [antig] são inicialmente ensaiadas. Dependendo do resultado: Em nefelómetros automáticos deste tipo, 2 [antig] são inicialmente ensaiadas. Dependendo do resultado: São testadas novas [] São testadas novas [] É testada o excesso de antig É testada o excesso de antig

19 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda End-point nephelometers Medida no ponto máximo da reacção Medida no ponto máximo da reacção Medida de branco ou no inicio da reacção Medida de branco ou no inicio da reacção Valor intrapolado de uma curva de calibração Valor intrapolado de uma curva de calibração Variações Variações Particle enhanced Particle enhanced

20 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Particle enhanced nephelometry São utilizadas particulas de latex conjugadas com anticorpo ou antigénio competidor São utilizadas particulas de latex conjugadas com anticorpo ou antigénio competidor Aumento de sensibilidade Aumento de sensibilidade

21 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Ensaios Requisitos Requisitos Qualquer fluido Qualquer fluido Soro Soro Plasma Plasma Urina Urina CSF CSF Deve ser diluído (para não interferir na leitura) Deve ser diluído (para não interferir na leitura) Amostras ricas em lipídios devem ser clarificadas por filtração ou ultracentrifugação Amostras ricas em lipídios devem ser clarificadas por filtração ou ultracentrifugação Amostras ictéricas ou hemolisadas Amostras ictéricas ou hemolisadas Não afectam a nefelometria Não afectam a nefelometria Afectam a turbidimetria Afectam a turbidimetria

22 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Outro ensaios homogéneos CEDIA (Cloned enzyme donor assay) -galactosidade em 2 fragmentos inactivos -galactosidade em 2 fragmentos inactivos enzyme donnor enzyme donnor Enzyme acceptor Enzyme acceptor A reacção imune junta-os activando a enzima. A reacção imune junta-os activando a enzima. Se não houver antigénio o anticorpo liga-se à enzima inactivando-a Se não houver antigénio o anticorpo liga-se à enzima inactivando-aEMIT (Enzyme multiplied immunoassay technique) Aumento ou diminuição da actividade enzimatica com a reacção Ag-Ab Aumento ou diminuição da actividade enzimatica com a reacção Ag-Ab

23 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Imunofluorescência Anticorpos conjugados com compostos fluorescentes Anticorpos conjugados com compostos fluorescentes Conjugado utilizado como revelador directo Conjugado utilizado como revelador directo Aumento de 10 a 1000 vezes na sensibilidade Aumento de 10 a 1000 vezes na sensibilidade Grande aumento na rapidez de detecção Grande aumento na rapidez de detecção Vantagens relativamente à RIA: Vantagens relativamente à RIA: Tão sensivel Tão sensivel Reagentes mais estáveis Reagentes mais estáveis Mais fácil de implementar Mais fácil de implementar

24 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Principais fluorocromos utilizados

25 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de imunofluorescência (I) Directas Directas Anticorpo directamente conjugado Anticorpo directamente conjugado Indirectas Indirectas Anticorpo secundário conjugado Anticorpo secundário conjugado Acopladas Acopladas Duas reacções acopladas Duas reacções acopladas Fluorescence polarization immunoassay Fluorescence polarization immunoassay Baseia-se no aumento na polarização da luz emitida quando um antigénio-FITC forma complexos imunes, o que se deve às restrições ao movimento rotacional do antigénio no complexo Baseia-se no aumento na polarização da luz emitida quando um antigénio-FITC forma complexos imunes, o que se deve às restrições ao movimento rotacional do antigénio no complexo

26 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de imunofluorescência (II) Fluorescent Quenching assay Fluorescent Quenching assay Método competitivo directo que utiliza [ab] fixa Método competitivo directo que utiliza [ab] fixa Competição para o ab entre o antigénio marcado e o não marcado (a testar) Competição para o ab entre o antigénio marcado e o não marcado (a testar) A fluorescência é absorvida (quenched) quando o antigénio marcado se liga ao anticorpo A fluorescência é absorvida (quenched) quando o antigénio marcado se liga ao anticorpo A intensidade de fluorescência é uma medida da quantidade de antigénio não marcado que competiu para o anticorpo A intensidade de fluorescência é uma medida da quantidade de antigénio não marcado que competiu para o anticorpo Método indirecto Método indirecto

27 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de imunofluorescência (III) Substrate labelled Fluorescent immunoassay Substrate labelled Fluorescent immunoassay Método indirecto Método indirecto Analito ligado a um modulador que influencia o sinal gerado Analito ligado a um modulador que influencia o sinal gerado Actividade do modulador influenciada pela ligação do Ab Actividade do modulador influenciada pela ligação do Ab

28 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de imunofluorescência (IV) Fluorescent energy transfer immunoassay Fluorescent energy transfer immunoassay Método competitivo Método competitivo Analito conjugado com FITC Analito conjugado com FITC Anticorpo ligado a Rodamina Anticorpo ligado a Rodamina Se o analito conjugado ligar ao anticorpo, por ressonância a energia do FITC excita a rodamina Se o analito conjugado ligar ao anticorpo, por ressonância a energia do FITC excita a rodamina Se por competição, o analito impedir o anticorpo de se ligar ao conjugado, não haverá excitação da rodamina Se por competição, o analito impedir o anticorpo de se ligar ao conjugado, não haverá excitação da rodamina

29 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Problemas da imunofluorescência Autofluorescencia Autofluorescencia Proteinas do soro ( nm) Proteinas do soro ( nm) Bilirubina ( nm) Bilirubina ( nm) Urina apresenta elevada linha de base Urina apresenta elevada linha de base Para obviar a estes problemas pode-se Para obviar a estes problemas pode-se Tratar a amostra com Tratar a amostra com Enzimas proteoliticas Enzimas proteoliticas Agentes oxidantes Agentes oxidantes Agentes desnaturantes Agentes desnaturantes Quenching Quenching Bilirrubina Bilirrubina Hemoglobina Hemoglobina Fotodestruição Fotodestruição Diminuição da fluorescência ao longo da excitação Diminuição da fluorescência ao longo da excitação

30 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Aglutinação Baseada na reacção ag-ab Baseada na reacção ag-ab Observada visualmente Observada visualmente Tipos: Tipos: Directa (ABO) Directa (ABO) IgM aglutina várias RBC IgM aglutina várias RBC IgG necessita de reagente de Coombs (anti-human-ab) para fazer a ponte IgG necessita de reagente de Coombs (anti-human-ab) para fazer a ponte Indirecta ou passiva Indirecta ou passiva Antigénio ligado a subtância inerte Antigénio ligado a subtância inerte Reversa Reversa Anticorpo ligado a substância inerte Anticorpo ligado a substância inerte

31 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Aglutinação de partículas Mais sensiveis que a aglutinação Mais sensiveis que a aglutinação Mensurável por nefelometria, turbidimetria, contagem de particulas Mensurável por nefelometria, turbidimetria, contagem de particulas Anticorpo ou antigéneo conjugado com particulas de látex Anticorpo ou antigéneo conjugado com particulas de látex Reacção ag-ab aglutina as particulas que saem de solução Reacção ag-ab aglutina as particulas que saem de solução A medida das partículas em solução é inversamente proporcional ao titulo a determinar A medida das partículas em solução é inversamente proporcional ao titulo a determinar

32 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Ensaio quimioluminescente Produção de luz por uma reacção quimica, habitualmente uma reacção de oxidação-redução Produção de luz por uma reacção quimica, habitualmente uma reacção de oxidação-redução O modo mais sensível de detecção em imunoensaios (atomole= a zeptomole= ) O modo mais sensível de detecção em imunoensaios (atomole= a zeptomole= ) Compostos utilizados: Compostos utilizados: Esteres de acridina (detecção do NaOH e H 2 O 2 ) Esteres de acridina (detecção do NaOH e H 2 O 2 ) Limite de detecção de 0.5 atomoles Limite de detecção de 0.5 atomoles Derivados do isoluminol (detecção com H 2 O 2 e um catalizador) Derivados do isoluminol (detecção com H 2 O 2 e um catalizador) Limite de detecção de 50 atomoles Limite de detecção de 50 atomoles

33 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Enzimas utilizadas em ensaios quimioluminescentes

34 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Ensaios em fase sólida ELISA ELISA Competitivo Competitivo Não competitivo-indirecto Não competitivo-indirecto

35 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Ensaios em fase sólida ELISA ELISA Sandwich ou de captura Sandwich ou de captura

36 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Resolver problemas do ELISA

37 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Electroforese de Imunoglobulinas Electroforese em agarose de alta resolução Electroforese em agarose de alta resolução Imunofixação Imunofixação Imunosubtracção Imunosubtracção Electroforese capilar Electroforese capilar

38 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Electroforese de Ig em agarose Electroforese + Corar com Ponceau S e secar

39 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Imunofixação Electroforese Electroforese Aplicação de tira de acetato decelulose com anticorpo monoespecifico para cada cadeia de Ig. Forma-se um precipitado onde houver Ig correspondente Aplicação de tira de acetato decelulose com anticorpo monoespecifico para cada cadeia de Ig. Forma-se um precipitado onde houver Ig correspondente Proteinas não pp são lavadas Proteinas não pp são lavadas Corar os pp com amido black nigrosin Corar os pp com amido black nigrosin

40 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Imunosubtracção

41 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Crioglobulinas (I) Tipo I Tipo I Monoclonal (IgG, IgM, IgA, raramente c.leves) Monoclonal (IgG, IgM, IgA, raramente c.leves) Tipo II Tipo II Mistas (2 ou mais Ig, sendo uma monoclonal) Mistas (2 ou mais Ig, sendo uma monoclonal) Tipo III Tipo III Policlonal Policlonal

42 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Crioglobulinas (II)


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