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Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Estudo do complemento.

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Apresentação em tema: "Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Estudo do complemento."— Transcrição da apresentação:

1 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Estudo do complemento

2 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda O sistema do complemento

3 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Testes funcionais do complemento (I) CH50 CH50 Baseada na lise pelo complemento de eritrócitos de carneiro sensibilizados com anticorpo de coelho anti-eritrócitos de carneiro Baseada na lise pelo complemento de eritrócitos de carneiro sensibilizados com anticorpo de coelho anti-eritrócitos de carneiro Diluições seriadas de soro teste são misturados com igual volume dos eritrócitos sensibilizados e incubados a 37ºC Diluições seriadas de soro teste são misturados com igual volume dos eritrócitos sensibilizados e incubados a 37ºC A reacção é parada com PBS frio A reacção é parada com PBS frio A lise é estimada pela [hemoglobina] por espectrofotometria A lise é estimada pela [hemoglobina] por espectrofotometria Comparação com 0% de lise (sem soro) e 100% lise (por acção de água pura). Comparação com 0% de lise (sem soro) e 100% lise (por acção de água pura). Actividade do complemento dada pela diluição necessária para obter 50% de lise. Resultado expresso pelo inverso desta diluição em unidades de CH50/mL soro. Actividade do complemento dada pela diluição necessária para obter 50% de lise. Resultado expresso pelo inverso desta diluição em unidades de CH50/mL soro. Resultado baixo pode significar deficiência ou consumo Resultado baixo pode significar deficiência ou consumo Heterozigotos têm habitualmente valores normais-baixos de CH50 Heterozigotos têm habitualmente valores normais-baixos de CH50

4 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Testes funcionais do complemento (II) AH50 AH50 Semelhante ao CH50, por se basear na quantificação da lise de eritrócitos Semelhante ao CH50, por se basear na quantificação da lise de eritrócitos Baseia-se no facto de a via alterna ser activada por e provocar a lise de eritrócitos de coelho Baseia-se no facto de a via alterna ser activada por e provocar a lise de eritrócitos de coelho Activação da via clássica inibida por quelatação do Ca 2+ com EGTA Activação da via clássica inibida por quelatação do Ca 2+ com EGTA A maior parte das deficiências de C3 por consumo são devidas à activação da via alterna, devido ao ciclo de amplificação do C3 A maior parte das deficiências de C3 por consumo são devidas à activação da via alterna, devido ao ciclo de amplificação do C3

5 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Testes funcionais do complemento (III) Outros Outros ELISA ELISA Detecção do componente terminal da cascata de activação clássica Detecção do componente terminal da cascata de activação clássica C5b C5b Medida de lise de liposomas contendo enzimas Medida de lise de liposomas contendo enzimas Utiliza processos automáticos de quimica clínica Utiliza processos automáticos de quimica clínica

6 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Testes funcionais do complemento (IV) Testes funcionais para componentes do complemento Testes funcionais para componentes do complemento Fazer CH50 ou AH50 com Fazer CH50 ou AH50 com Complementação por soros deficientes num componente Complementação por soros deficientes num componente Complementação com componentes puros Complementação com componentes puros

7 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Testes quantitativos do complemento Quantificação de proteínas do complemento Quantificação de proteínas do complemento Identificação das deficiências Identificação das deficiências Quantificação de produtos de hidrólise do complemento Quantificação de produtos de hidrólise do complemento Diferenciação entre deficiência e consumo Diferenciação entre deficiência e consumo C4a/C4 ou C4d/C4=> via clássica C4a/C4 ou C4d/C4=> via clássica Bb => via alterna Bb => via alterna C3a e C5a => via final (mas têm curtas semi- vidas, pelo que a Protein S é uma melhor alternativa) C3a e C5a => via final (mas têm curtas semi- vidas, pelo que a Protein S é uma melhor alternativa) Nefelometria Nefelometria

8 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda

9 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Colheitas Má colheita => deficiência de complemento Má colheita => deficiência de complemento Evitar >2 ciclos de congelação/descongelação Evitar >2 ciclos de congelação/descongelação Soro com crioglobulinas tem que ser testado de imediato Soro com crioglobulinas tem que ser testado de imediato Utilizar tubo sem anticoagulante, deixar coagular (30 min a 37ºC ou 60 a RT), centrifugar e guardar a –70ºC Utilizar tubo sem anticoagulante, deixar coagular (30 min a 37ºC ou 60 a RT), centrifugar e guardar a –70ºC Tempo excessivo de espera origina deficiência (as proteases celulares degradam as proteínas do complemento) Tempo excessivo de espera origina deficiência (as proteases celulares degradam as proteínas do complemento) Crioglobulinas, complexos imunes, bactérias e particulas activam o complemento in vitro provocando falsa deficiência Crioglobulinas, complexos imunes, bactérias e particulas activam o complemento in vitro provocando falsa deficiência Hemólise interfere na leitura Hemólise interfere na leitura

10 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Análise Genética do C4

11 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda O Gene do C4 localiza-se no MHC-III

12 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda O gene do C4 dois genes: dois genes: C4A (ácido) C4A (ácido) C4B (básico) C4B (básico) 6p21.3 6p exões 41 exões intrão 9 tem 7 Kb intrão 9 tem 7 Kb Se intrão 7 presente o gene tem 21 Kb Se intrão 7 presente o gene tem 21 Kb Se intrão 7 ausente o gene tem 16 Kb. Se intrão 7 ausente o gene tem 16 Kb.

13 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Os Módulos RCCX Módulo RCCX Módulo RCCX RP1 RP1 C4 C4 CYP21 CYP21 Tenascin X Tenascin X Normalmente 2 módulos em tandem Normalmente 2 módulos em tandem RP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXB RP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXB

14 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Os alelos C4A e C4B C4B C4B o aminoácido nucleofílico (His) ataca o grupo tiol de um resíduo de cisteína, formando um intermediário acídico o aminoácido nucleofílico (His) ataca o grupo tiol de um resíduo de cisteína, formando um intermediário acídico C4A C4A a asparagina, não sendo nucleofílica não origina a formação do intermediário pelo que a reacção de ligação ás outras moléculas é mais lenta a asparagina, não sendo nucleofílica não origina a formação do intermediário pelo que a reacção de ligação ás outras moléculas é mais lenta

15 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda TaqI - RFLP (quantificação dos elementos RCCX)

16 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Taq I e pshA I RFLP

17 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Imunofixação de C4A e C4B

18 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda

19 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Determinação de fenótipo C4

20 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda PFGE para genotipagem C4 M S => 75Kb; L => 85Kb M S => 75Kb; L => 85Kb B LS => 105Kb; LL => 115 Kb B LS => 105Kb; LL => 115 Kb T LSS => 135 Kb LSS => 135 Kb LLS => 140 Kb LLS => 140 Kb LLL => 150 Kb LLL => 150 Kb

21 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Número de módulos RCCX RP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXB


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