UICC HPV e CÂNCER CERVICAL CURRÍCULO.

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1 UICC HPV e CÂNCER CERVICAL CURRÍCULO

2 Capítulo 2.d 01 Triagem e diagnóstico - Análise e tipagem de HPV
Slide Capítulo 2.d Triagem e diagnóstico - Análise e tipagem de HPV Prof. Suzanne Garland MD Diretora de Pesquisa Microbiológica, Chefe de Microbiologia Clínica e Doenças Infecciosas Hospital Real de Mulheres Melbourne, Austrália Associado Prof. Sepehr Tabrizi Cientista de Pesquisa Sênior, Departamento de Microbiologia 01 Este módulo introduzirá você à estrutura de vírus do papiloma humano e à metodologia utilizada para detectar este vírus. 2

3 Partículas semelhantes a Vírus (VLP)
Slide Partículas semelhantes a Vírus (VLP) 02 Análogos não infecciosos de um vírus patogênico VLP-L1 se une in vitro a capsídeos vazios ou “VLPs” Produção de VLP não padronizada Sistemas diferentes de expressão, métodos preparativos, abordagens de controle de qualidade Formatos de identificação variam (direto vs. indireto) Sem padrão ouro para estabelecimento de limite para resultado positivo Poucas comparações entre laboratórios As vacinas atualmente aprovadas são baseadas nas partículas semelhantes aos vírus, as quais são similares em estrutura à estrutura natural do vírus. Elas não são infecciosas, uma vez que não existe DNA viral na VLP. As VLP são automontadas a partir das proteínas que participam do revestimento externo do vírus: L1 é a proteína estrutural principal do papilomavírus, enquanto L2 é a proteína de menor importância no capsídeo. As VLP se montam na cultura de células do tecido a partir da superexpressão da proteína L1 apenas ou com as proteínas L1 e L2. Uma variedade de linhagens celulares incluindo o vírus da vacina, vírus Semliki Forest, bacilovírus e levedura são usados para produzir VLP. As VLP L1 mostraram ser altamente imunogênicas. A variação dos sistemas de expressão eucarióricas está disponível para a expressão das proteínas recombinantes. Os sistemas da expressão diferentes podem resultar em modificações de diferentes resultados pós-traducionais da proteína recombinante. Isso pode afetar o envolvimento ou a imunogenicitidade da escolha do sistema de expressão é, portanto, importante para projetar a vacina. 3

4 Partículas semelhantes a Vírus (VLP)
Slide Partículas semelhantes a Vírus (VLP) 03 VLPs podem ser analisadas utilizando técnicas de microscopia eletrônica A estrutura da VLP pode ser analisada utilizando técnicas de microscopia eletrônica. Esta fotografia mostra um grupo de VLP, com as proteínas estruturais principais fora dos quais elas são montadas de maneira claramente visível. 4

5 Detecção de anticorpo para HPV
Slide Detecção de anticorpo para HPV 04 Anticorpos A presença representa infecção passada ou presente Pode ser gerado contra proteínas de HPV precoces (E) ou proteínas tardias (L) Anticorpos neutralizantes L1 se correlacionam com proteção iniciada por vacina A resposta do anticorpo ao papilomavirus pode ser detectado no soro e na mucosa. A presença de anticorpos indica a exposição atual ou passada ao HPV. Nem todas as pacientes soroconvertidas e tornaram-se soropositivas, apenas cerca de 50 a 60% das mulheres soroconvertidas e o tempo médio da infecção em soroconversão é de 8 meses. A resposta do anticorpo é dirigida contra a proteína L1 do HPV do capsídeo ou contra proteínas expressas precocemente na replicação intracelular, como E6 e E7. 5

6 Detecção de anticorpo para HPV
Slide Detecção de anticorpo para HPV 05 Vários ensaios foram desenvolvidos para detectar anticorpos no soro/mucosa Teste imunoabsorvente de ligação a enzima (ELISA): medidas de Ig total, neutralizantes e não neutralizantes Testes de ligação competitiva, por exemplo, teste Luminex competitivo (cLIA): medidas de Ig neutralizantes a um epítopo apenas, mas a todas as classes de Ig Teste de pseudovírus: medidas de Ig neutralizantes total, todas as subclasses Western blot Radio-imuno precipitação A maioria dos testes comuns envolve a detecção dos anticorpos contra a L1 do HPV, a principal proteína do capsídeo e é específico para diferentes tipos de HPV. Um teste imunoabsorvente de ligação da enzima, (conhecido como ELISA) ou teste de ligação competitiva é utilizado mais comumente. Com esses testes, os anticorpos específicos ao capsídeo são detectados. As proteínas E6 e E7 podem ser detectadas usando ELISA, a técnica de western blot ou ensaios de radio-imunoprecipitação. Os exames diferentes avaliam diferentes coisas. Alguns, tais como o teste competitivo de Luminex (cLIA), avaliação de anticorpos neutralizantes específicos para epítopo, enquanto os outros (por exemplo, ELISA) avaliam os anticorpos totais. 6

7 06 Detecção de DNA do HPV por microscopia no tecido Slide
Imuno-histoquímica (antígeno específico para o grupo) Exame Papanicolau: detecta células precursoras de câncer Os métodos de imuno-histoquímica são geralmente utilizadas para visualizar diretamente a presença das proteínas de HPV utilizando os anticorpos específicos para HPV genéricos nas células e no tecido. O exame Papanicolau foi descrito pela primeira vez pelo Dr. Papanicolaou em Ele sustentou o teste de tempo e mostrou que, quando completamente dispersos com bom controle de qualidade e cobertura da população apropriada, as taxas de incidência de câncer cervical e a mortalidade podem ser reduzidas. Entretanto, é um procedimento custoso e apresenta relativamente baixa sensibilidade. Devido ao fato de que o câncer leva um grande tempo para desenvolver a partir das alterações celulares iniciais, a citologia deve ser repetida durante alguns anos. Sua função principal é perceber lesões precursoras (displasia de alto grau). Isso pode ser tratado de maneira adequada, que evita o desenvolvimento do câncer. Os esfregaços para citologia são especialmente bons na identificação dos carcinomas de célula escamosa, mas não adenocarcinomas. Estes são localizados no canal endocervical e mais difícil de atingir ao usar os métodos de coleta celular de rotina. 7

8 07 Técnicas de Detecção Molecular para DNA do HPV Slide
Métodos de Amplificação Amplificação de sinal Captura Híbrida (HC2) Amplificação Alvo Reação em cadeia da polimerase - DNA do HPV por PCR RNAm do HPV A detecção imunológica do HPV pode ser difícil devido ao fato de que as proteínas tardias do capsídeo são expressas somente nas infecções produtivas e as proteínas precoces são expressas somente em pequenas quantidades. O DNA do HPV pode ser detectado no cólo do útero, vagina e na genitália externa utilizando métodos que detectam e identificam os tipos e grupos de HPV específicos (como os tipos de HPV de baixo risco e de alto risco). O DNA do HPV pode ser amplificado de maneira seletiva por uma série de reações que levam a um aumento na sequência viral presente na amostra biológica. Os procedimentos de coleta, armazemamento de amostra e preparo de amostra devem ser considerados durante a determinação de uma técnica adequada para detectar o DNA do HPV. Os genomas do HPV e seus transcritos podem ser detectados usando as técnicas de hibridização, como Captura Híbrida 2, um método de citologia com base líquida. Outros métodos de detecção incluem o uso de PCR, que amplifica o DNA do HPV pelo aumento das sequências virais presentes em uma célula ou em amostras de tecido (amplificação alvo). Existem duas abordagens principais utilizadas na detecção de HPV por reação em cadeia da polimerase (PCR): consenso de PCR e PCR específico ao tipo. 8

9 Teste de Captura Híbrida 2
Slide Teste de Captura Híbrida 2 08 Teste aprovado atualmente pelo FDA formato de tubo em 1995; formato de microtitulação em 1999 Destinado para trabalhar com amostra de célula cervical esfoliada Kit de coleta recomendado inclui escova e meio de transporte de amostra Coleta de células endo e ectocervicais Na Captura Híbrida 2, o DNA alvo encontrado em uma amostra é inicialmente desnaturado e, então, hibridizado com um coquetel de sonda de RNA específico para HPV. Os híbridos RNA-DNA resultantes são capturados na superfície de uma microplaca bem revestida com anticorpos específicos para os híbridos RNA-DNA. Os híbridos imobilizados, então, reagem com anticorpos conjugados com fosfatase alcalina para os híbridos de RNA-DNA e são detectados com substrato quimioluminescente. Várias moléculas de fosfatase alcalina são conjugadas a cada anticorpo. Os múltiplos anticorpos conjugados se ligam a cada híbrido capturado o que resulta em uma amplificação substancial do sinal. Como o substrato é cortado pela fosfatase alcalina ligada, uma luz é emitida, a qual é medida como unidades de luz relativa (RLU) em um luminômetro. A intensidade de luz emitida denota a presença ou a ausência de DNA alvo na amostra. 9

10 Teste de Captura Híbrida 2
Slide Teste de Captura Híbrida 2 09 Sensibilidade de 5000 genomas/amostra Sonda para detecção de HPV de baixo risco HPV dos tipos 6, 11, 42, 43, 44 Sonda para HPV de alto risco HPV dos tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68 Resultados não específicos ao tipo Sem controle para entrada do número de células Boa comparação entre laboratórios O teste de Hybrid Captur ® 2 é projetado para detectar 5 tipos de HPV de baixo risco e 13 de alto risco, incluindo a maioria dos tipos oncogênicos prevalescentes, HPV-16 e HPV-18. Para cada amostra testada, os resultados informarão o médico se a paciente é positiva para um tipo de HPV de alto risco, um tipo de HPV de baixo risco e os tipos de HPV de baixo risco ou se a paciente é negativa. O teste não identifica o tipo específico de HPV que está presente, mas de preferência distingue entre uma infecção de alto ou baixo risco. Todas as pacientes com um tipo de HPV de alto risco seguirão o mesmo protocolo de tratamento da paciente, sem considerar o tipo de HPV que está presente. 10

11 Reação em cadeia da polimerase
Slide 10 Muito sensível em cerca de 1 a 10 cópias / células Permite o teste de vários tipos de amostra Permite o teste de amostras estocadas com qualidade ruim de DNA Testes de consenso: geralmente com alvo na região L1 Conservado Primers variam: MY09/MY11 SPF1/SPF2 PGMY09/PGMY11 GP5+/GP6+ Detecção de variedade dos sistemas: ELISA dot blot O PCR é baseado na amplificação alvo e pode ser utilizado ao detectar o DNA específico os genótipos de HPV presentes. Várias quantidades pequenas de DNA podem ser detectados com esta técnica. A desvantagem a esta alta sensibilidade é que impurezas ou contaminação cruzada podem levar a um resultado falso-positivo. Existe uma ampla variedade de técnicas de PCR que podem ser utilizadas para aumentar a sequência viral e a escolha depende de vários fatores: a região ou gene de interesse, por exemplo, da região do L1 ou o gene E6, e a especificidade do teste. Os produtos amplificados podem ser analisados ao usar ELISA, hibridização por tira linear ou dot-blot. 11

12 Diferentes metodologias de PCR
Slide Diferentes metodologias de PCR 11 Teste AMPLICOR ® para HPV Teste LINEAR ARRAY® para HPV Teste de genotipagem INNO-LiPA ® Genotipagem de HPV em cortes incluídos em parafina Os cortes do tecido podem ser muito antigos e submetidos à degradação do DNA (inclusive durante a extração) Com base na amplificação e na detecção de 13 tipos de HPV de alto risco, o Teste de HPV AMPLICOR, da Roche Diagnostics, é um exame de alta especificidade, no qual o limite inferior de detecção é menor ou igual a 100 cópias/PCR para todos os genótipos de HPV de alto risco. A sensibilidade do teste é desafiada pela alta carga celular (viral) humana. Geralmente, nenhuma reatividade cruzada é observada para os tipos de HPV de baixo risco. Além disso, a exclusividade do teste foi realizada em 61 microorganismos adicionais que podem estar presentes nas amostras genitais coletadas com swab. Os resultados do teste são altamente reprodutíveis em laboratório entre operadores e dias de teste. O teste de genotipagem de HPV Linear Array da Roche Diagnostics utiliza os primers biotinilados para definir uma sequência de nucleotídeos dentro da região L1 polimórfica do genoma do HPV que tem aproximadamente 450 pares de base. Um grupo de primers de HPV é desenhado para amplificar o DNA do HPV a partir de 37 genótipos incluindo 13 genótipos de alto risco. Um par de primer adicional orienta o gene da beta-globulina humana para fornecer um controle para a adequação celular, extração e amplificação. A Genotipagem do HPV por INNO-LiPA da Innogenetics também é baseada no princípio da hibridização reversa semelhante ao Linear Array. Uma região L1 muito menor (65 pares de bases) do genoma do HPV é amplificada usando os primers biotinilados e desnaturados. Os amplicons biotinilados são hibridizados com sondas de oligonucleotídos específicas imobilizadas na fita. Depois da hibridização e da lavagem severa, a fosfatase alcalina conjugada com estreptavidina é adicionada e se liga a algum híbrido biotinilado formado anteriormente. A incubação com cromôgeno resulta em um precipitado roxo/marrom e os resultados podem ser interpretados visualmente. O material da biopsia incluído em parafina pode ser influenciado pela fixação e armazenamento do bloco, o qual pode impactar fundamentalmente a qualidade do DNA presente. Um método sensível e preciso de detecção dos genótipos de HPV em biopsias incluídas em parafina é, portanto, importante. Este teste usa a amplificação de um alvo mais curto, isto é, 65 pares de base, que aumenta a probabilidade de detecção do DNA parcialmente degradado e é, portanto, mais apropriado para a avaliação do DNA de HPV no tecido armazenado. 12

13 Diferentes metodologias de PCR
Slide Diferentes metodologias de PCR 12 Formulário do chip de DNA do HPV Microarray para HPV Ensaio de citometria de fluxo O método de detecção para HPV usando PCR precisa da detecção dos produtos amplificados usando sondas de oligonucleotídos de tipo específico. O CHIP da genotipagem foi introduzida para a detecção em dowstream e da tipagem dos amplicons de HPV. É fabricado pelas 22 sondas de oligonucleotídeo específicas ao tipo de HPV e um controle (sonda de beta-globulina) e pode detectar os vários tipos de HPV. Um scanner a laser é necessário para a detecção. Os microarrays de DNA de alta densidade são parte de uma nova geração de testes para papilomavírus humanos (HPV) usados para detectar tipos de HPV de alto risco. Consiste de uma série de testes de milhares de lugares microscópicos de oligonucleotídeos, denominados características, cada uma contém picomoles de uma sequência específica de DNA. A hibridização orientada por sonda é geralmente detectada e quantificada pela detecção de alvos marcados por quimioluminescência, fluóforo ou por prata para determinar a abundância relativa de sequências de ácido nucleico no alvo. 13

14 13 Outras metodologias para detectar os tipos de HPV Slide
Tecnologia xMAP® da Luminex Norchip - Proficiência ao HPV Outras abordagens novas também estão sendo desenvolvidas atualmente para detectar os tipos de HPV. A tecnologia de ensaio por suspensão com base em bolhas (xMAP, Luminex Corporation) permite a análise simultânea de anticorpos com especificidades para até 100 antígenos diferentes em uma reação única e a triagem de alto rendimento de até 1000 soros por dia. Este método foi desenvolvido a partir das tecnologias (citometria de fluxo, micro-esferas, laseres, processamento de sinal digital e química tradicional). O DNA pode ser amplificado e, então, genotipado nas bolhas Luminex usando as sondas de hibridização. A proficiência do HPV Norchip é um RNAm para E6/E7 baseado no diagnóstico de HPV para detecção precoce de tipos de HPV que provoca câncer. Esta tecnologia ainda está sob avaliação atualmente. 14

15 Limitações e desafios 14 Slide Diversa variação de ensaios
Sensibilidade e especificidade diferentes Falha de leitura dos controles disponíveis, GQ, CQ Existem vários testes que podem ser utilizados com base na morfologia celular (citologia, histologia), detecção de proteínas celulares (imuno-histoquímica), amplificação de sinal, amplificação alvo) e a detecção de anticorpos anti-HPV. Há uma grande variação entre os métodos de teste na sensibilidade e na especificidade de um teste para detectar HPV. 15

16 15 Uso prático de métodos de teste de DNA para HPV Slide Clínico
Triagem Triagem de exame Papanicolau equivocados / com valores limítrofes Monitoria de tratamento pós-displasia Epidemiologia Áreas geográficas de vigilância Prevalência do HPV Prevalência do genótipo do HPV Vacina Execução pré e pós vacina Estudos de eficácia para a vacina Diferentes regiões em todo o mundo Os métodos de teste de DNA do HPV pode ser usado em várias situações, que incluem a prática clínica, vigilância para a presença de tipos de HPV e a prevalência por país ou regiões. Onde as vacinas foram introduzidas, esses métodos podem ser ferramentas valiosas para avaliar o impacto da vacinação sobre os tipos de HPV relacionado à vacina antes e depois da execução. 16

17 Slide 16 Obrigado Esta apresentação está disponível em Obrigado pela sua atenção! Esta apresentação pode ser baixada do website da UICC. 17