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Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Métodos Celulares.

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1 Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Métodos Celulares

2 Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Células Sanguíneas

3 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Macrofagos Monócitos Neutrófilos PMN Eosinófilos Basófilos Linfócitos plaquetas eritrócitos Células do S.I. Outras células do Sangue T B NK CD4 CD8

4 Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Purificação de células do sistema Imunológico

5 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Cell Separation Technologies Centrifugation : Density Centrifugation : Density Filtration : Size Filtration : Size Flow Cytometry (FACS) Flow Cytometry (FACS) Size Size Granularity Granularity Fluorescence Fluorescence Batch affinity systems : antibody, avidin-biotin Batch affinity systems : antibody, avidin-biotin Batch magnetic systems Batch magnetic systems Paramagnetic difference Paramagnetic difference

6 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Separação em gradiente de densidade Numa centrifugação sedimentam primeiro as partículas mais densas, que por sua vez impedem as menos densas de sedimentar Numa centrifugação sedimentam primeiro as partículas mais densas, que por sua vez impedem as menos densas de sedimentar Ficol: polisacarideo Ficol: polisacarideo Agrega eritrócitos tornando-os mais densos Agrega eritrócitos tornando-os mais densos Metrizamida (composto denso contendo iodo) Metrizamida (composto denso contendo iodo) Densidade ajustável em função da concentração Densidade ajustável em função da concentração

7 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Separação em Gradiente descontínuo de densidade density Ficoll-hypaque PBMC Soro plaquetas

8 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Separação em gradiente contínuo de densidade (II)

9 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Separação Imunomagnética

10 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Two-Step Labeling One-Step Labeling Immunomagnetic Labeling of Cells Cell Magnetic bead Target antigen FITC Antibody (IgG) Cell PBL HER-2/neu

11 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Paramagnetic particles Large size Large size 1 to 5 um in diameter 1 to 5 um in diameter Magnetic susceptibility of a cell: High Magnetic susceptibility of a cell: High Small number of beads per cell Small number of beads per cell beads/cell beads/cell Commercially available Commercially available

12 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Paramagnetic colloidal beads Colloidal size Colloidal size 50 to 200 nm 50 to 200 nm Spread in solution (Brownian Motion) Spread in solution (Brownian Motion) Magnetic susceptibility of a cell: Low Magnetic susceptibility of a cell: Low Large number of beads per cell Large number of beads per cell ,000 beads/cell ,000 beads/cell

13 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Molecular Magnetic Labeling Erbium ion (Er 3+ ) Erbium ion (Er 3+ ) Paramagnetic ion Paramagnetic ion High atomic magnetic dipole moment High atomic magnetic dipole moment Ionic binding to the cell surface Ionic binding to the cell surface Ferritin Ferritin Paramagnetic protein Paramagnetic protein Hollow protein shell (13 nm) Hollow protein shell (13 nm) Deposition of Fe 2 O 3 the cavity (7 nm) Deposition of Fe 2 O 3 the cavity (7 nm)

14 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Magnetic Labeling

15 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Cell Separation Based on Antigen Expression Level

16 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda MACS ® Cell separation system Magnet magnetic cell non-magnetic cell Plunger Remove the magnet Unlabeled cells Immunomagnetically labeled cells Separation column

17 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda HG4100 ® Cell Separation system Resuspension Aspiration Incubation magnetic cell non-magnetic cell

18 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Quadrupole Magnetic Flow Sorter (QMS)

19 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda High Gradient Magnetic Separator (HGMS)

20 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Cell Separation by the QMS

21 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Lymphocyte cell separation by the QMS 6% 38% 96% CD4 + cells 38% 26% 6% 12% 99% CD8 + cells abab Feed

22 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda CD34 cell isolation by the QMS 0.67% 0.02% 88.5% Feed b a Total cell load = 2 x10 8 cells; CD34 cell recovery = 81%; Throughput = 1.75 x 10 5 cells/s

23 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Colony Formation from CD34+ Cells CFU-GM BFU-E CFU-Mix CD34+ cells (immature)

24 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda PANNING Aderência celular a uma superfície sólida Aderência celular a uma superfície sólida Monócitos e macrófagos são naturalmente aderentes Monócitos e macrófagos são naturalmente aderentes Outras células podem aderir se a superfície estiver conjugada com anticorpos apropriados Outras células podem aderir se a superfície estiver conjugada com anticorpos apropriados Panning directo Panning directo Panning indirecto Panning indirecto

25 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Purificação positiva e negativa Purificação Positiva Purificação Positiva Panning Panning Imuno-separação magnética Imuno-separação magnética Centrifugação gradiente densidade Centrifugação gradiente densidade Centrifugal elutriation Centrifugal elutriation Formação de rosetas Formação de rosetas Citometria de Fluxo Citometria de Fluxo Purificação Negativa Purificação Negativa Todos os anteriores Todos os anteriores Citotoxicidade mediada por Anticorpo/complemento Citotoxicidade mediada por Anticorpo/complemento

26 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Rosetas Nos anos 70 Nos anos 70 Linfócitos T formam rosetas com SRBC Linfócitos T formam rosetas com SRBC Melhor rendimento se: Melhor rendimento se: SRBC tratados c/ neuraminidaseSRBC tratados c/ neuraminidase SRBC tratados c/ AETSRBC tratados c/ AET (2-aminoethylisothiouronium bromide) Método barato mas pouco prático e de baixo rendimento Método barato mas pouco prático e de baixo rendimento

27 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Método de lise mediada pelo complemento Selecção negativa de células Selecção negativa de células Passos: Passos: Marcação das células a eliminar c/ anticorpos Marcação das células a eliminar c/ anticorpos Indução da lise celular c/ complemento de coelho Indução da lise celular c/ complemento de coelho

28 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Selecção negativa c/ L-LME L-Leucine methyl Ester (L-LME) é metabolizado nos lisosomas originando um metabolito tóxico L-Leucine methyl Ester (L-LME) é metabolizado nos lisosomas originando um metabolito tóxico Colocando as células em contacto c/ L-LME, os monócitos e NK são destruídos Colocando as células em contacto c/ L-LME, os monócitos e NK são destruídos Separar as células mortas com lymphoprep Separar as células mortas com lymphoprep

29 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Isolamento de linfócitos de orgãos linfóides secundários As células estão fracamente agregadas As células estão fracamente agregadas São separáveis por acção mecânica São separáveis por acção mecânica Forçar o tecido a passar repetidamente por uma malha de aço fino Forçar o tecido a passar repetidamente por uma malha de aço fino Utilizar a suspensão celular obtida, depois de purificada por lymphoprep Utilizar a suspensão celular obtida, depois de purificada por lymphoprep Descartar os restos de tecido Descartar os restos de tecido

30 Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Análise de Células

31 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Estudo de populações celulares por Citometria de fluxo Utilização de CD14/CD45 para definir a população de linfócitos Utilização de CD14/CD45 para definir a população de linfócitos

32 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Efeito de um gating correcto

33 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Estudo de activação linfocitária (I) Método de Activação Método de Activação Antigénio especifico Antigénio especifico pouco útil para culturas de linfócitos humanos pouco útil para culturas de linfócitos humanos Requer activação in vitro para enriquecimento prévio Requer activação in vitro para enriquecimento prévio Mitogénio Mitogénio Concanavalina A (ConA) Concanavalina A (ConA) Phytohemaglutinina (PHA) Phytohemaglutinina (PHA) Proteina A de staphylococcus Proteina A de staphylococcus Pokweed mitogen Pokweed mitogen Anticorpos / Interleuquinas Anticorpos / Interleuquinas Células T CD3 CD2 CD28 TCR Células B IgM CD20 T+B Ionoforo A23187 Ionomicina Ester de forbol IL-2 IL-4

34 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Estudo de activação linfocitária (II) Radioactividade Radioactividade 3 H-dTTP ( Incorpora-se no DNA em cada divisão) 3 H-dTTP ( Incorpora-se no DNA em cada divisão) Bromo desoxi-uridina (BrdU) Bromo desoxi-uridina (BrdU) Incorpora-se no DNA em cada divisão Incorpora-se no DNA em cada divisão É Fluorescente Detectável por Citometria de fluxo É Fluorescente Detectável por Citometria de fluxo Medida da [Ca 2+ ] intracelular Medida da [Ca 2+ ] intracelular O Ca é um dos primeiros mensageiros secundários da activação celular O Ca é um dos primeiros mensageiros secundários da activação celular

35 Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Medida da actividade citotoxica Incubação das células alvo (linhas tumorais) com 51 Cr Incubação das células alvo (linhas tumorais) com 51 Cr Se o estudo for de ADCC (antibody dependent cell mediated citotoxicity) as células alvo devem estar sensitizadas com anticorpo Se o estudo for de ADCC (antibody dependent cell mediated citotoxicity) as células alvo devem estar sensitizadas com anticorpo Incubação das células alvo com as NK/LAK Incubação das células alvo com as NK/LAK Medida da radioactividade libertada no sobrenadante da cultura Medida da radioactividade libertada no sobrenadante da cultura a=lise experimental cpm (efector + alvo) b=lise espontânea cpm (meio+alvo) c=lise máxima (SDS+alvo)


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