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CITOMETRIA DE FLUXO Aplicações práticas Patrícia Cisneiros dos Santos Bióloga- UCSAL Mestranda do curso de Imunologia-UFBa.

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1 CITOMETRIA DE FLUXO Aplicações práticas Patrícia Cisneiros dos Santos Bióloga- UCSAL Mestranda do curso de Imunologia-UFBa

2 PRINCÍPIOS BÁSICOS DE CITOMETRIA DE FLUXO CITO METRIA FLUXO Célula Medida Movimento Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)

3 ANTICORPOS MONOCLONAIS

4

5 CITÔMETRO DE FLUXO SISTEMA FLUIDO SISTEMA ÓTICO SISTEMA ELETRÔNICO

6 SISTEMA FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO SISTEMA ÓPTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ. SISTEMA ELETRÔNICO: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR.

7 FOCO DO LASER CÂMARA DE FLUXO SISTEMA FLUIDO CONVERGÊNCIA HIDRODINÂMICA

8 Low Sample Pressure 12µl/min Sample Laminar Flow LOW DIFFERENTIAL PRESSURE Sheath Sample Laminar Flow Sheath FILTRO DE AR GERA PRESSÃO AO FLÚIDO ENVOLVENTE SHEATH HIGH DIFFERENTIAL PRESSURE High Sample Pressure 60µl/min

9 SISTEMA ÓPTICO SISTEMA É COMPOSTO POR UM LASER E LENTES PARA MOLDAR E ALINHAR O FEIXE DO LASER. A COLEÇÃO DE LENTES SERVE PARA CAPTAR A DISPERSÃO E A LUZ FLUORESCENTE EMITIDA PELAS PARTÍCULAS QUE INTERAGEM COM O FEIXE DO LASER. UM SISTEMA DE ESPELHOS ÓPTICOS E FILTROS DIRECIONAM OS COMPRIMENTOS DE ONDAS DA LUZ PARA OS DETECTORES ÓPTICOS ESPECÍFICOS.

10 FACSCalibur FL1 Red Diode Laser ~635 nm SSC FL3 FL4 670LP 661/16 585/42 488/10 90/10 Beam Splitter DM 560SP Fluorescence Collection Lens DM 640LP Half Mirror 488/ nm Blue Laser FSC Diode Focusing Lens FL2 530/30 Beam Combiner Flow Cell SISTEMA ÓTICO

11 Filtros Ópticos – coletar sinais de luz Espelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que seu número é deixado passar e menor que seu número é refletido. Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de seu número é deixado passar e acima de seu número é refletido. Espelhos BP (bandpass) = só deixa passar o comprimento de onda específico. SP 500 LP 500 BP500/30 LongpassShortpassBandpass Filtro Detector – célula fotoelétrica

12 ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC) ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC) LASER

13 SISTEMA ELETRÔNICO CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS PROPORCIONAIS, DIGITALIZANDO-OS PARA SEREM ANALISADOS NO COMPUTADOR.

14 A medida proveniente de cada detector é denominada Parâmetro Parâmetro 1 FSC Parâmetro 2SSC Parâmetro 3FL1 Parâmetro 4FL2 Parâmetro 5FL3 SISTEMA ELETRÔNICO

15 FLUORESCÊNCIA O que é a fluorescência ? Comprimento de onda gerado pela excitação dos fluorocromos, após atingir a absorção máxima da luz do laser Luz Fluorescente emitida de menor energia e maior comprimento de onda Fluoresceína = 530 nm Luz Incidente de maior energía Fluorocromo CO 2 H O OHOH = 480 nm

16 FLUORESCÊNCIAS O detector de FL-1 (Fluorescência 1) capta luz de comprimento de onda 530 nm, que corresponde à luz verde. O detector de FL-1 (Fluorescência 1) capta luz de comprimento de onda 530 nm, que corresponde à luz verde. O detector de FL-2 (Fluorescência 2) capta luz de comprimento de onda 570 nm, o que corresponde à luz laranja. O detector de FL-2 (Fluorescência 2) capta luz de comprimento de onda 570 nm, o que corresponde à luz laranja. O detector de FL-3 (Fluorescência 3) capta luz de comprimento de onda 650 nm, o que corresponde à luz vermelha. O detector de FL-3 (Fluorescência 3) capta luz de comprimento de onda 650 nm, o que corresponde à luz vermelha.

17 SISTEMA ELETRÔNICO

18 DISPERSÃO POLIMORFONUCLEARES LINFÓCITOS MONÓCITOS DEBRIS/HEMÁCIAS/PLAQUETAS BLASTOS VOLUME (FS) GRANULOSIDADE (SS)

19 DISPERSÃO: Side Scatter Forward Light Scatter Linfócitos Monócitos Neutrófilos

20 Visão dos dados coletados Side Scatter Forward Light Scatter CD3 FITC CD4 PE DOT PLOT: FSC x SSC e FL1 x FL2

21 ALGUNS MARCADORES CD3 - presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos timócitos. CD4 - 55% a 65% das células T periféricas maduras, especialmente no subtipo auxiliar, mas também em monócitos, macrófagos e células dendríticas CD8 - 25% a 35% das células T maduras do subtipo citotóxica. CD19 - presente em mais de 95% das células B. CD20- assim como o CD19 está presente em todas as células B maduras do tecido linfóide e sangue periférico. CD45- expresso quase exclusivamente em células hematopoiéticas podendo apresentar as formas : CD45RA ou CD45RO. CD56 - marcador de NK, não está expresso em células B, monócitos ou granulócitos.

22 CD10 CD2 CD20 CD3 CD7 CD19 CD22 CD23 CD26 CD5 Leucemias Linfociticas ou Enfermidade residual mínima CD3 CD7 HLA DR CD 42a CD 61 CD19 CD33 CD13 CD14 CD34 Leucemias mielóides CD3 CD7 CD2 CD19 CD5 CD56 Linfomas e Mielomas LEUCEMIAS

23 APLICAÇÕES CLÍNICAS - Análise da subpopulação linfocítica - Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas - Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo - Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas - Monitoramento quimioterapêutico / doença residual mínima - Análise de reticulócitos - Diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna - Detecção de anticorpos antiplaquetários - Análise do conteúdo de DNA - Quantificação de células progenitoras (Stem cells) - Avaliação imunológica de paciente transplantado, de infusão linfocitária

24 OBRIGADA A TODOS!


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