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LMA – Diagnóstico laboratorial Nydia S. Bacal LMA – OMS Leucemia Promielocítica Aguda LMA M3 clássica LMA M3 variante.

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1 LMA – Diagnóstico laboratorial Nydia S. Bacal LMA – OMS Leucemia Promielocítica Aguda LMA M3 clássica LMA M3 variante

2 Classificação da OMS

3 LMA 99P - LMA12 Robin Foá – Atibaia 03/2007

4 Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007

5 LMA não categorizada > 60% dos casos de LMA Base para classificação é a morfologia, grau de maturação e citoquímica Não existem anormalidades citogenéticas recorrentes O critério diagnóstico é 20% de blastos na MO (em 500 células) ou SP (200 leucócitos) Se houver leucopenia acentuada pode se fazer esfregaços do buffy coat Biópsia de MO é necessária para o diagnóstico de leucemia aguda hipocelular em S.P. e M.O. Recomendações para classificação são aplicáveis apenas em amostras obtidas antes da quimioterapia.

6 IMUNOFENOTIPAGEM Fundamental para o diagnóstico de: LMA-M0 LMA-M7 Pode ser importante no diagnóstico de: LMA-M6b (Leucemia eritróide pura) LMA-M3 (hipogranular)

7 Diagnóstico Laboratorial LMA e LPA – LMA M3 Diagnóstico na rotina PML-RARα qualitativo PCR e FISH – HIAE PML-RARα quantitativo - Nichols– 72horas(s/ estabilidade) FLT3 qualitativo – Nichols NPM – Exon 12 – Nichols C-Kit – qualitativo – Nichols – 72horas(s/ estabilidade) CBFβ MHY11 (inv 16) – Quali/quantitativo– Nichols – 72horas(s/ estabilidade) FISH – envio de células AML1-ETO (t:8;21) – Quali e quantitativo – Nichols – 72horas(s/ estabilidade) FISH – HIAE MLL PTD 11q23 - FISH – HIAE Não Disponíveis: t(11;17) PLZF-RARα/NuMA- RARα/ t(5;17)NPM-RARα/ t(17;17)STSTSb-RARα CEBPα ; BAALC ; ERG ; NRAS ; Valor Prognóstico e Futuro

8 Forma Clássica - LPA - LMAM3 Faggot Cells Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

9 Forma Variante LPA - M3v S. P.

10 Forma Variante LPA - M3v Citoquímica para MPO – deve ser fortemente positiva MO Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

11 Forma Hiperbasofílica Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

12 Diferenciação Granulocítica – MO normal Painéis de anticorpos monoclonais CD34CD117HLA-DR I II III IV V Mieloblasto Pro- Mielócito Meta- Neutrófilo mielócito mielócito Bastão CD117 CD15CD11b CD15CD11bCD16CD15CD11b+forteCD16+forte CD34/CD117/CD45/CD13.33 CD16/CD13/CD45/CD11b CD13+forteCD33+forteCD13+forteCD33+forteCD13+fracoCD33+fracoCD13+CD33+fracoCD13+forteCD33+fraco CD15 Dra. Maria Silvia – Florianópolis Santa Catarina I II III IV V

13 Imunofenotipagem Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

14 LMA M3 CD45xSS HLA-DRxCD45 CD33xCD45 CD2xCD45 CD13xCD45 CD34xCD45 CD117xCD45 CD56xCD45 CD71xCD45 MPO(c)xCD45

15 IMUNOFENOTIPAGEM Antígenos mielomonocíticos (CD13, CD15 e CD33) e ausência de expressão de antígenos monocíticos (CD14, incluindo My4, Leu M3 e Mo2) e ausência de HLA-DR Estudos iniciais - ausência de CD34 e CD7,mas Edward et al (1999) observaram que 41% dos casos de LPA com CD34 (+). HLA-DR (+) em LPA e HLA-DR (-) em LMA com morfologia não M3 Dr. Alberto Orfao – Universidade de Salamanca

16 LMA - TRIAGEM FENOTÍPICA DE ALTERAÇÕES GENÉTICAS t(8;21) MPO+, CD13, CD33, CD19+, CD56+ Comumente LMA-M2 t(15;17) MPO+, CD13+ heterogêneo, CD33++ homogêneo, CD15-, CD34-, HLA-DR- LMA Promielocítica – FAB M3 Hurwitz, CA et al, Blood, 80: 3182, 1992 Orfao, A et al, Haematologica, 84:405, 1999

17 111 casos de LMA de novo 38 morfologia de M3 (34 morfologia típica e 4 M3v) PML-RARα - 39 dos 111 (35%) 34 morfologias M3 e 5 casos foram classificados como M0 (2 casos), M1(1 caso) e M2 (2 casos)

18 ORFAO et al Quatro grupos conforme Morfologia / genética molecular 1) M3 / PML- RARα + (n=34) 2) Não-M3 / PLM-RARα + (n=5) 3) M3 com PML- RARα - (n=4) 4) Não-M3 / PML- RARα – (n=68)

19 ORFAO et al CD33 homogêneo nas células blásticas em 82% dos casos CD13 em todas as células leucêmicas com padrão heterogêneo de expressão (100%) Expressão de CD34/CD15 (100%) Discriminação entre M3/PLM-RARα (+) e M3/PLM-RARα (-) : ٭ padrão fenotípico CD34/CD15 ٭ expressão de CD13 ٭ presença de subtipo maior de células blásticas.

20 ORFAO et al A sensibilidade da imunofenotipagem para selecionar casos PLM-RARα foi de 100% e especificidade 99% HLA-DR negativo é provavelmente o achado mais específico ( 91%)

21 Petriconi R. MO 30/12/ FL3-H -> 80% Blasti CD33 + N O molecole CD33/cell = Caboni ext 19/12/ FSC-Height -> AML M Caboni ext 19/12/ CD34 FITC -> 70% Blasti CD34+ CD33+ N O molecole CD33/cell = 2992 Expressão e quantificação do CD33 em LMA / LPA Robin Foá – Atibaia – 03/2007

22 LEUCEMIA PROMIELOCÍTICA AGUDA (LPA) LPA é caracterizada por uma translocação específica t(15;17) t(15;17) envolve o gene receptor do ácido retinóico RAR-alpha no cromossomo 17 e o gene PML, um fator de transcripção, no cromossomo 15, gerando o gene quimérico PML-RAR-alpha o resultado da proteina quimérica PML/RARα é crucial para a patogênese da LPA Dr. Zago – Atibaia 03/2007

23 standard-risk: median DFS = 3.2 years years from CR p< standard: 85 events 47 intermediate: 56 events 34 high: 91 events 75 intermediate-risk: median DFS = 1.6 years high-risk: median DFS = 0.62 years SLD de acordo com o grupo de risco citogenético- molecular Median: Standard: 3.2 years (C.I. 95%: 38,6 - 60,6) Intermediate: 1.6 years (C.I. 95%: 36,9 - 63,1) High: 0.62 years (C.I. 95%: 39,2 - 59,7) Mancini et al, Blood 2005

24 Translocações Cromossômicas Envolvendo o Gene RARα Genes X Genes X-RAR Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

25 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS Artefatos, não define alvo para MRD Rápido, barato1 diaImunofluores.Proteína PMLNúcleo Qualidade do RNA, falsos positivos Rápido, sensível, define alvo p/ MRD 1 diaRT-PCRfusão PML/RARa RNA Laborioso, uso de radioativos, não define alvo para MRD Específico7 diasSoutherngenes PML e RARα DNA Custo, não define alvo para MRD Céls. intérfase2-3 dias FISH Crescimento em cultura; fusões crípticas não são detectadas, não define alvo para MRD Específico13-14 dias Cariótipot(15;17)Cromosso mos DesvantagemVantagemTMétodoAlvoEstrut. Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

26 Imunofluorescência anti-PML 5 3 DR5 RXR RXR RAR RAR PML RA PML LMA – não LPMa Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

27 Acute Myeloid Leukemia Tyrosine Kinase Receptor Mutations GeneMutationFrequency FLT-3Duplication 15-30% Point Mutation 5-10% FMSPoint Mutation 10-20% c-KITVarious <10% GeneMutationFrequency FLT-3Duplication 15-30% Point Mutation 5-10% FMSPoint Mutation 10-20% c-KITVarious <10%

28 Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007

29 E F S (%) years FLT3 wildtype Core Binding Factor AML Prognostic impact of TK receptor mutations FLT3 mutation p<0.001 Robin Foá – Atibaia – 03/2007

30 E F S (%) years O S (%) FLT3 wildtype p=0.03 p<0.001 FLT3 mutation c-KIT wildtype c-KIT mutation Core Binding Factor AML Prognostic impact of TK receptor mutations Robin Foá – Atibaia – 03/2007

31 LMA. Carcaterísticas clínicas de acordo com o status FLT3 FLT3 pos FLT3 neg Pts150 (20%) 582 Idade (mediana) (48.5) (40.5) Sexo F/M 86/64 290/292 G.B. (mediana) (126.0) (28.2) Blastos (%) (85) (46) Robin Foá – Atibaia – 03/2007

32

33

34 OligomerizationHeterodimerizationAc NLS MB Falini et al., NEJM 352: , 2005 NPM 1 Kb Mutations None (wild type) GATCTCTG....GCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation A (77%) GATCTCTGTCTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation B (13%) GATCTCTGCATGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation C (2%) GATCTCTGCGTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation D (2%) GATCTCTGCCTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation E (2%) GATCTCTG....GCAGTCTCTTGCCCAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation F (2%) GATCTCTG....GCAGTCCCTGGAGAAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Pelo menos 40 variantes da mutação NPM já foram identificadas Exon 12

35 WB: anti-NPM (376) NIH 3T3 NPM wild-type NPM-mutated NPM MUTANTS LOCALIZE ABERRANTLY IN THE CYTOPLASM GFP NPMm GFP NPMwt C WT Mutated Robin Foá – Atibaia – 03/2007

36 Tratamento: Fatores Prognósticos Pacientes idosos (>60 anos ? ; >80 anos) Sanz et al (PETHEMA+GIMEMA) –Baixo risco: GB / μl –Alto risco: GB10.000/ μ l –Risco intermediário:GB<10.000/ μl e Plt<40.000/ μl Persistência do PML/RARα pós-consolidação Mau prognóstico mas não modificam o tratamento: CD56+, isoforma S do PML/RARα e mutações do FLT3 Não são fatores de mau prognóstico: anormalidades citogenéticas adicionais (30%) Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

37 GIMEMA-AIEOP AIDA Trial Risco de recaída de acordo com monitoramento precoce de RT-PCR após consolidação Months RT-PCR negative RT-PCR positive Probability p= Robin Foá – Atibaia – 03/2007

38 Sobrevida da LPA em pacientes tratados por recaída hematológica vs molecular Molecular Hematologico P = 0.01 Robin Foá – Atibaia 03/2007

39 Expressões gênicas em LMA: grupos moleculares e resultados Clear correlation between cytogentic groups and gene expression (Kohlmann, 2003, Genes, Chrom Cancer) Identification of a HOX signature in samples with normal cytogenetics (Debernardi, 2003, Genes, Chrom Cancer) 54 AML pediatric samples with a different signature that is associated with outcome (Yagi, 2003, Blood) Robin Foá – Atibaia – 03/2007

40 Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007

41 Objective 1: Clinical accuracy of the microarray test as compared to standard leukemia laboratory methods (gold standard) Gold standard Diagnostic Information MorphologyCytogeneticsImmunophenotyping FISHCytochemistry PCR Microarray-based gene expression profile n = 4000 patients AmpliChip Leukemia MILE: Clinical Objectives Robin Foá – Atibaia – 03/2007

42 M icroarray I nnovations in LE ukemia A retrospective and prospective study to compare laboratory standard leukemia tests with a new microarray-based gene expression test AmpliChip Leukemia The MILE multi-center pre- marketing study Robin Foá – Atibaia – 03/2007

43 The MILE study will be conducted in collaboration with the European Leukemia Network plus US participants European Leukemia Network (WP13) Site 1 Montpellier / France Site 2 Munich / Germany Site 3 Berlin / Germany Site 4 Rome / Italy Site 5 Padua / Italy Site 6 Salamanca / Spain Site 7 Cardiff / UK Principal Investigator: T. Haferlach US Sites – Memphis, La Jolla AmpliChip Leukemia Key hematological centers participating in Phase-I Robin Foá – Atibaia – 03/2007

44 Accuracy by cross-validation: 95.65% - based on 30fold CV - HG-U133 Plus ,647 samples for training Classification performance of 17 - class algorithm: MDS not included in data set Robin Foá – Atibaia – 03/2007

45 AmpliChip Leukemia Test MILES Stage I data presented at ASH conference 2006 [852] An International Multi-Center Microarray Study for the Molecular Classification of Leukemia Identifies Novel Sub-Groupings in MDS Overlapping with AML. Session Type: Oral Session Authors: Ken I. Mills, Torsten Haferlach, Jesus M. Hernandez, Wolf-Karsten Hofmann, Alexander Kohlmann, Mickey Williams, Lothar Wieczorek Date/Time: Tuesday, December 12, :45 AM Session Info: Simultaneous Session: Myelodysplastic Syndromes: Molecular Biology (8:00 AM-10:00 AM) Robin Foá – Atibaia – 03/2007

46 Illumina

47 Genes CBF Subunity (promotes interaction with DNA) Subunity (direct contact with DNA) Proteins CBF AML-1 (21q22) Core Binding Factor

48 Genes CBF Subunity (promotes interaction with DNA) Core Binding Factor Subunity (direct contact with DNA) Proteins rhd Runt homology domain (RUNX1) CBF (16p13) AML-1 (21q22)

49 CBF -MHY11 inv (16) rhd CBF MYH11 rhd CBF rhd ETO CBF AML1-ETO t(8;21) Wild type Core Binding Factor Translocations in AML

50 5-12% AML 8t(8;21)21

51 LEUCEMIAS MIELÓIDES AGUDAS – 912 casos analisados MDS – 59 casos / BIFENOTÍPICAS – 10 casos no HIAE CASOS DE DOENÇAS ONCOHEMATOLÓGICAS (Novembro 1991 a Julho 2006)

52 OBRIGADA PELA ATENÇÃO ! Nydia Grupo de Citometria de Fluxo do Laboratório Clínico HIAE Ana Claudia Miranda Brito Alexandra Cavalcante Sonia Tsukasa Nozawa Ruth Hissae Kanayama

53 I II III IV Monoblasto Promonócito Monócito Macrófago CD34CD117HLA-DR CD117HLA-DR CD11bCD15+fracoCD14 CD11bCD14 CD34/CD117/CD45/CD13.33 CD14/CD33/CD45/CD34 Diferenciação Monocítica – MO normal Painéis de anticorpos monoclonais CD13+forteCD33+forte CD13+forteCD33+forte CD13+CD33+ CD11bCD15CD14 CD13+forteCD33+forte HLA-DRHLA-DR Dra. Silvia – Florianópolis Santa Catarina


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