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ELETROFORESE Técnica de separação de partículas através de corrente elétrica Técnica de separação de partículas através de corrente elétrica 1-Identificação.

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1 ELETROFORESE Técnica de separação de partículas através de corrente elétrica Técnica de separação de partículas através de corrente elétrica 1-Identificação de substâncias 1-Identificação de substâncias 2-Homogeneidade de sistemas biológicos 2-Homogeneidade de sistemas biológicos 3-Determinação de pontos isoelétricos 3-Determinação de pontos isoelétricos

2 Pólo - Pólo +

3 ELETROFORESE LIVRE Arne Tiselus- Premio Nobel em 1948 ELETROFORESE LIVRE Arne Tiselus- Premio Nobel em 1948 Este método de solução livre, era bastante limitado devido á perturbações: -ondas mecânicas -movimentos de convecção do líquido pelo aquecimento da solução causado pela aplicação da diferença de potencial Perturbações fazem com que a eletroforese se torne processo muito pouco reprodutível, com as cargas de mesma natureza não migrando juntas, mas sim, dispersas.

4 Métodos para minimizar estes problemas: 1- MATRIZES RÍGIDAS- SUPORTES papel de filtro, sílica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros.

5 A eletroforese que utiliza suporte é também conhecida como eletroforese de zona: Iniciada por König em 1937 na separação de veneno de cobra recorrendo a papel de filtro como meio-suporte, em 1946, Martin retomou esta eletroforese. Iniciada por König em 1937 na separação de veneno de cobra recorrendo a papel de filtro como meio-suporte, em 1946, Martin retomou esta eletroforese..

6 Dependendo do suporte que utilizamos para a eletroforese e da natureza das macromoléculas, podemos separá-las: Dependendo do suporte que utilizamos para a eletroforese e da natureza das macromoléculas, podemos separá-las: 1- com base na carga 2- com base em seu tamanho

7 Os suportes em gel apresentam grande capacidade de separar as moléculas com base no tamanho molar Eletroforese em suporte de papel é muito eficiente no que diz respeito a separação de partículas com grande diferenças de cargas Eletroforese em suporte de papel é muito eficiente no que diz respeito a separação de partículas com grande diferenças de cargas

8 Substâncias anfóteras indispensável manter constante o pH do meio durante a eletroforese, pelo uso de soluções-tampão. Os principais tipos de eletroforese são: 1- Eletroforese capilar 2- Eletroforese em gel

9 ELETROFORESE EM GEL 1.Separar partículas por diferença de carga e massa 1.Separar partículas por diferença de carga e massa 2.Aplicaçao de corrente elétrica sobre o gel 3.Isolar DNA RNA e proteínas 3.Isolar DNA RNA e proteínas

10 Eletroforese em gel de agarose 1-Gel gelitificado de agarose 2-Separa fragmentos longos de DNA 3-Corrente elétrica sobre gel 4-Partículas menores tem maior velocidade de chegar ate o pólo positivo

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13 Eletroforese em gel de policrilamida 1-Fragmentos pequenos de DNA ou outra molecula 2-Recupera e purifica amostras 3-Em cubas de vidros 4-Aplicacao de corrente

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17 O gel de policrilamida pode ser: 1-Desnaturante : com presenca de ureia, separa e purifica fitas simples 2-Não desnaturante : separa e purifica fitas duplas, sem presenca de ureia

18 ELETROFORESE CAPILAR EM ZONA OU EM SOLUÇÂO LIVRE

19 1- A ELETROFORESE CAILAR DE ZONA OU SOLUÇÂO LIVRE é o modo mais utilizado devido à simplicidade do equipamento e maior facilidade na otimização das condições experimentais. 2- o capilar e os reservatórios contendo os eletrodos são cheios com um tampão (denominado eletrólito carreador), o qual conduz a corrente elétrica e fornece a capacidade tamponante. 3-se introduz uma amostra contendo uma mistura iônica no capilar como uma banda de pequena espessura

20 4-Quando o campo elétrico é aplicado, forças elétricas atuam nas cargas da camada difusa. 5-os íons arrastam moléculas de água, formando um fluxo que é direcionado para o catodo, enquanto a parede do capilar permanecer negativa.

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25 1-Para decifrar o código genético humano, os cientistas do Projeto Genoma tiveram de enfrentar a enorme tarefa de localizar as dezenas de milhares de genes que se encontram no DNA humano e em seguida fazer o seqüenciamento dos cerca de 3 bilhões de pares de bases contidas nos cromosomas Eletroforese Capilar no Seqüenciamento Automático de DNA

26 2-Com a tecnologia normalmente usada no início dos anos 90, essa tarefa levaria bem mais de10 anos, com o custo de alguns bilhões de dólares. Foi o desenvolvimento da técnica de eletroforese capilar, combinada ao uso de radiação laser, que permitiu acelerar o processo, uma vez que essa técnica potencialmente é de 50 a 100 vezes mais rápida que o método tradicional.

27 3-A técnica tradicional para seqüenciamento de DNA é o método de Sanger, desenvolvida por Frederick Sanger, um dos ganhadores do prêmio Nobel de Química de Esse método utiliza enzimas especiais para sintetizar fragmentos de DNA que terminam quando uma determinada base (adenina, citosina, guanina ou timina) aparece ao longo da seqüência.

28 Na análise STR, os examinadores devem: 1.extrair o DNA das células da amostra quantificar o DNA 2. transformar o DNA utilizando a ténica de PCR 3. utilizar eletroforese capilar para extrair o DNA transformado CURIOSIDADE:

29 4-A análise via Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica mais recente que pode transformar o DNA em uma amostra bem menor. 5-O banco de dados CODIS do FBI utiliza amostras que passaram pela análise STR examinando 13 locais. A probabilidade de duas pessoas possuírem perfis STR de 13-loci idênticos é de cerca de uma em um bilhão.

30 Eletroforese Capilar em Gel (ECG)

31 1- Utilizada exclusivamente para separação de macromoléculas 2- Quando a razão carga/raio dos analitos é tão próxima, que não é possível separá-los com o uso da eletroforese de zona tradicional. 3- Íons menores migram mais rapidamente enquanto que solutos maiores ficam mais tempo retidos.

32 Princípio da Eletroforese Capilar em Gel

33 4- Teve início com a utilização de colunas preenchidas com géis químicos. 5- Esse método foi descartado dado o grande número de problemas que surgiram,como: - aparecimento de bolhas (perda de condutividade), - retenção de fragmentos com alto peso molecular, - degradação do gel por hidrólise.

34 6- Tais problemas levaram à formulação de novos sistemas, denominados géis físicos. 7- Géis físicos: matrizes poliméricas hidrofílicas, dissolvidas em tampão apropriado -eliminar o fluxo eletroosmótico através de uma ligação covalente com os grupos da superfície capilar -evitar a extrusão do gel durante operação do sistema, através da ligação covalente com o gel

35 8- Os géis são estruturas delicadas, sujeitas a mudanças de morfologia pela ação da temperatura temperatura pH pH força iônica força iônica concentração do meio. concentração do meio.

36 9- Uma das principais vantagens de realizar separações por ECG é que o formato do capilar, preenchido com gel possibilita a dissipação eficiente do calor gerado pelo efeito Joule, em razão da geometria do capilar e das propriedades anti-convectivas do gel.

37 Seqüenciamento do DNA Diferentes sistemas de revelação dos géis: a) brometo de etídio; b) nitrato de prata; c) raio – X; d) quimiluminescência; e) coomasie blue e f) fast blue BB salt, a e ß naftil acetato.

38 Aplicações 1- Identificação de pessoas: em testes de paternidade, comparando o DNA do suposto pai, da mãe e do filho; 2- na identificação de criminosos. 3- Na Industria Farmacêutica (Vacinas, Reagentes de diagnóstico); 4- Na Agropecuária (Animais e plantas transgênicos).

39 Como é feito o exame de paternidade? 2. Extração do DNA 3. Amplificação do DNA 1. Coleta do sangue 3. Digestão do DNA 4. Eletroforese 5a. Southern Blotting

40 5b. Hibridização da membrana de nylon 6. Visualiza ç ão Figura Inclusão - Observe que um dos alelos (banda) do filho é proveniente da mãe e o outro alelo proveniente do suposto pai. Neste caso, a paternidade fica comprovada. Figura Exclusão - Observe que um dos alelos (banda) do filho é proveniente da mãe. O outro alelo, no entanto, difere dos alelos do suposto pai. Neste caso, ocorreu uma exclusão de paternidade.


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