Prof. Dr. Francisco Prosdocimi Replicação do DNA Prof. Dr. Francisco Prosdocimi 1

Mitose / Meiose 2

Como acontece a síntese do DNA?

Meselson-Stahl experiment 1957 Cresceram E. coli em meio com N-15 e depois voltaram pra N-14 Purificação do DNA das bactérias Três tipos de DNA N-15 + N-15 N-15 + N-14 N-14 + N-14 Ao aquecer o N-15 + N-14 e separar as fitas ficava claro que uma fita continha N-15 e outra N-14

Replicação semi-conservativa

Origens de replicação Locais com um contexto de sequência específico Ligam proteínas específicas Quando acionadas, essas proteínas permitem o início da replicação

Origens de replicação 7

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Replicação DNA Polimerase III Sentido 5’ → 3’ Nucleotídeos 3P são adicionados Liberação de Pirofosfato http://207.207.4.198/pub/flash/24/menu.swf 9

Primase Ribonucleoproteína Liga-se à helicase em procariotos formando o chamado primossomo Sintetiza um primer de RNA contendo aproximadamente 11 bases; fornece 3’ OH DNA polimerase lenta e sujeita a erros Evita a progressão da forquilha uma vez que a fita líder anda mais rápido

Micrografia, bolha de replicação Forquilhas de replicação 11

Forquilha de replicação

Replicação das fitas Fita líder Fita retardada Primase age uma vez Primase age várias vezes 1967, Fragmentos de Okasaki Okazaki R, Okazaki T, Sakabe K, Sugimoto K. Mechanism of DNA replication possible discontinuity of DNA chain growth. Jpn J Med Sci Biol. 1967 Jun;20(3):255-60

Primase na fita retardada Deslocamento da forquilha de replicação Primase faz primer

Direções de replicação na Forquilha

Desenovelamento do DNA Retirada das histonas Proteínas de ligação a fita simples (SSBPs) DNA helicase Quebra pontes de H DNA topoisomerases Tiram a tensão

Forquilha de replicação Polaridade da síntese define fitas líder e retardada (descontínua) 17

DNA polimerase Enzimas que catalisa a reação de síntese do DNA Adiciona nucleotídeos tri-fosfato à extremidades 3’OH livre Alongamento da cadeia de DNA sempre é feito na direção 5’>3’ (endonuclease 5’>3’) Incapaz de fazer DNA do zero (precisa ter extremidade 3’OH livre) Possui mecanismo de correção de erros (exonuclease 3’>5’)

Tipos de DNA polimerase DNA polimerase I Descoberta em 1956 (Kornberg pai) Função precisa descoberta apenas em 1969: remove o primer de RNA da fita descontínua DNA polimerase III Descoberta em 1970 (Kornberg filho) Principal enzima que realiza a replicação em procariotos DNA polimerase II Lenta, envolvida em reparo do DNA

DNA Replication DNA Pol precisa de um molde inicial Primase: gera um molde de RNA complementar A DNA Pol III agora é capaz de adicionar bases à extremidade 3’OH 20

Eliminação dos fragmentos de Okasaki DNA Pol I 21

Mecanismo da enzima Ligase 22

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Repare na posição do primer de RNA Visão geral Repare na posição do primer de RNA 24

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Reparo pela Polimerase Mecanismo de verificação (Proof-reading) DNA-polimerase possui Uma atividade de polimerização 5’→ 3’ Uma atividade de exonuclease 3’→ 5’ 26

Reparo pela Polimerase Mecanismo de verificação (Proof-reading) DNA-polimerase possui Uma atividade de polimerização 5’→ 3’ Uma atividade de exonuclease 3’→ 5’

DNA Repair Checagem de pareamento incorreto (eucariotos) Proteínas especiais para reparo do erro 28

E as extremidades dos cromossomos? 29

Doenças causadas por problemas no mecanismos de replicação Ataxia de Friedreich's dano progressivo no sistema nervoso (problemas musculares, na fala e doenças no coração) forma mais comum das ataxias herdadas A seqüência GAATTC se repete, quando existem mais de 40 repetições, o indivíduo apresenta a doença. Xeroderma pigmentosum envelhecimento precoce aumento na incidência de câncer Falha no mecanismo de reparação do DNA causado pela luz UV 31

Ciclo celular A replicação do DNA é regulada temporalmente Fase S do ciclo celular Checkpoints do ciclo celular Ciclinas

Conclusões Replicação semi-conservativa Bolha de replicação avança em duas direções Fita líder e fita retardada Helicases e topoisomerases desenrolam o DNA Primase faz o primer DNA polimerase III, DNA polimerase I DNA ligase Telomerase