Análise Computacional de Seqüências Nucleotídicas e Protéicas BLAST Antonio Basílio de Miranda 24/11/2004

BLAST – Basic Local Alignment and Search Tool Provavelmente a ferramenta computacional mais utilizada em biologia molecular e bioinformática Busca seqüências armazenadas nos bancos de dados pela similaridade entre a estrutura primária da seqüência query e as armazenadas Anotações (características) descritas para seqüências armazenadas podem ser transferidas para a seqüência query desde que suas estruturas primárias sejam semelhantes O maior problema é definir um “cut-off”, limite onde as similaridades encontradas entre a query e os hits não sejam mais significativos

BLAST – Basic Local Alignment and Search Tool É um método heurístico para alinhamentos locais Projetado especificamente para buscas em bancos de dados Idéia básica: bons alinhamentos irão conter pequenos trechos de combinações iguais

BLAST Existem vários “sabores” e tipos de BLAST: Nucleotídeo Proteína Traduzido Genomas

BLAST Nucleotídeo: Nucleotídeo-nucleotídeo (blastn) Megablast Megablast descontínuo Busca por hits curtos e quase perfeitos Busca em cromatogramas

BLAST Proteína: Proteína-proteína (blastp) PHI-BLAST e PSI-BLAST (através da obtenção de perfis) Busca por hits curtos e quase perfeitos Busca no banco de dados de domínios conservados (rps-blast) (Smart, PFam e COG) Busca pela arquitetura de domínios (cdart)

PHI-BLAST e PSI-BLAST PHI-BLAST: Quais outras seqüências protéicas contém tanto a ocorrência do padrão P e são homólogas a query P na vizinhança das ocorrências dos padrões? PSI-BLAST: Construção de uma matriz de valores posição-específica (position specific scoring matrix, PSSM)

BLAST Traduzido: query traduzida x banco de dados de proteínas (blastx) query de proteína x banco de dados traduzido (tblastn) query traduzida x banco de dados traduzido (tblastx)

BLAST Genomas: Galinha, vaca, porco, cachorro, ovelha, gato Amostras ambientais Homem, camundongo, rato Fugu rubripes, zebrafish Insetos, nematódeos, plantas, fungos, malária Genomas microbianos, outros genomas eucarióticos

BLAST - algoritmo 1. Filtrar as regiões de baixa complexidade 2. Criar as query words (de comprimento 3 para sequências protéicas e 11 para DNA) através do uso de uma janela deslizante MEFPGLGSLGTSEPLPQFVDPALVSS MEF EFP FPG PGL GLG

BLAST - algoritmo 3. Utilizando uma matriz de substituição (PAM, BLOSUM), contar todas as possíveis palavras de tamanho 3 ou 11 contra a query 4. Selecionar um limite (neighborhood word score threshold - T) para manter as sequências mais significativas (normalmente umas 50 por query)

(Parênteses – matrizes de substituição) O que é uma matriz de substituição? É uma matriz representando todas as possíveis trocas entre aminoácidos, onde um valor é atribuído a cada uma destas trocas Esses valores são obtidos através da contagem dessas trocas tomando-se como base umdeterminado modelo evolutivo

Parênteses – matrizes de substituição)

BLAST - algoritmo 5. Repetir os passos 3 e 4 para cada query word no passo 2 6. Organizar as palavras de alta pontuação em uma árvore de busca M E E P F G

BLAST - algoritmo 7. Procurar em cada sequência no banco de dados uma combinação com uma query word de alta pontuação. Cada combinação será uma “semente” para um alinhamento sem gaps. 8. Extensão das combinações 8.1. BLAST original: extensão das combinações à esquerda e à direita da “semente” usando alinhamentos sem gaps. Esta extensão irá continuar enquanto o score aumentar ou pelo menos continuar o mesmo. Esta extensão é o chamado HSP (High Scoring Pair).

BLAST - algoritmo 8.2. Atualmente: combinações ao longo da mesma diagonal (Dot plot) com uma distância A entre as duas são reunidas e a extensão se dá com a sequência maior. 9. Utilizando uma contagem limite S, manter somente as combinações estendidas com score mínimo igual a S.

BLAST - algoritmo 10. Determinar a significância estatística de cada combinação remanescente 11. Tentar estender os HSPs de cada combinação remanescente 12. Mostrar os alinhamentos locais (dea cordo com Smith-Waterman).

(Parênteses – matrizes de homologia)

Resultado (BLASTN)

Resultado (formatação)

Resultado (BLASTN) O output é dividido em cinco partes: 1. Um header contendo a versão do BLAST, data da compilação, referência, RID, etc. 2. Uma visão gráfica dos alinhamentos 3. Um sumário com uma descrição em uma linha de cada hit 4. Os alinhamentos 5. Rodapé com a descrição detalhada dos parâmetros de busca empregados, o banco de dados, etc. Existem várias opções de formatação dos resultados.

Resultado (header)

Resultado (graphical overview)

Resultado (one-line descriptions)

Resultado (links) G: Gene U: UniGene E: GEO Profile (dados de expressão gênica e hibridização genômica obtidos por tecnologia high-throughput)

Resultado (alignments)

HSP – High Scoring Pairs Segmentos onde o alinhamento possui alta qualidade

HSPs

Resultado (footer)

CDART