Curso Intensivo de Anotação de ESTs de Crinipellis perniciosa Eduardo Fernandes Formighieri Laboratório de Genômica e Expressão / UNICAMP Fevereiro - 2006.

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1 Curso Intensivo de Anotação de ESTs de Crinipellis perniciosa Eduardo Fernandes Formighieri Laboratório de Genômica e Expressão / UNICAMP Fevereiro - 2006

2 Programa 1.Introdução 2.Revisão de genômica 3.Introdução à anotação 4.BLAST 5.Interface de anotação

3 2. Revisão de Genômica Eduardo Fernandes Formighieri Laboratório de Genômica e Expressão / UNICAMP Fevereiro - 2006

4 Introdução Seqüenciamento de DNA Determinação da sua seqüência nucleotídica (ACGTs). A tecnologia de seqüenciamento atual exige que se quebre o DNA em pequenos fragmentos de cerca de 2.000 pares de bases (shotgun), exigindo a montagem dos fragmentos. (a montagem será detalhada posteriormente)

5 Introdução Exemplo de gel de eletroforese utilizado nos seqüenciadores de gel (ex.: 377). A diferença de tamanho permite a separação dos grupos de fragmentos, e esta “distribuição normal” da passagem dos fragmentos é representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada seqüência (read).

6 Projetos Genoma Tipos de projeto DNA – seqüenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas. Ex.: X. fastidiosa ESTs – seqüenciamento de cDNA, feitos a partir de bibliotecas de mRNA. Bibliotecas feitas para diferentes situações. Ex.: ESTs de café

7 Projetos Genoma Esquema muito resumido para projetos genoma. O seqüenciamento pode ser total ou parcial. A montagem feita por diferentes programas. O objetivo final pode ser um produto, publicações ou respostas.

8 Projetos Genoma Estratégias de seqüenciamento DNA –Shotgun de genoma inteiro –Shotgun de pedaços do genoma (cosmídeos) –Primer walking ESTs –Tradicional –Orestes

9 Bancos de dados Alguns dos principais BDs biológicos NCBI (link) – National Center for Biotechnology Informationlink EBI (link) – European Bioinformatics Institutelink KEGG (link) – Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomeslink GO (link) – Gene Ontology Consortiumlink COG (link) – Clusters of Orthologous Groups of proteinslink

10 3. Geral de anotação Eduardo Fernandes Formighieri Laboratório de Genômica e Expressão / UNICAMP Fevereiro - 2006

11 Introdução – base Anotação de genes Anotar um gene é postular função ao produto deste gene. Para DNA, inicialmente são localizados os ORFs. Para cDNA, busca-se a identificação do trecho seqüenciado. Utilizam-se diversos programas de comparação com dados genéticos conhecidos e buscas de padrões.

12 Introdução – base ORFS Os ORFs (Open Reading Frames) a partir de determinado tamanho são genes em potencial. ATG AAT GCT TGC ACC CCG TCA GGC CTG TAA ini fim Códon iniciador, região codificadora e códon terminador.

13 Introdução – base Código genético (Fonte das figuras: http://www.accessexcellence.org/AB/GG/genetic.html)

14 Introdução – metabolismo virtual

15 Anotação – inicial

16 Anotação – metabólica

17 4. BLAST Eduardo Fernandes Formighieri Laboratório de Genômica e Expressão / UNICAMP Fevereiro - 2006

18 BLAST – base Basic Local Alignment Search Tool Algoritmo BLAST (Alstchul et al.; 1990 – J. Biol., 215, 403-410) Implementações: NCBI BLAST e WU-BLAST Acesso via web / local Consulta de seqüências em BDs biológicos Alinhamento – sobreposição de trechos semelhante de duas seqüências (seqs). BLASt traz pontuação e mostra alinhamentos. Similaridade – grau de semelhança de seqs num alinhamento. Homologia – genes com ancestral comum (vide slide).

19 BLAST – conceitos 1 2 3 4 3´ “Genes nariz” Homólogos Ortólogos: 2 e 3; ancestral comum = 1 Ortólogos: 2 e 4; ancestral comum = 1 Parálogos: 3´ e 4; ancestral comum = 3 Duplicação Especiação

20 BLAST – programas BDs – nucleotídeos, proteínas, domínios, genomas específicos, dados particulares Blastp – prot / prot (distantes) Blastn – nt / nt (próximos) Blastx – nt trad / prot (novas seqs) Tblastn – prot / nt trad (regiões não anotadas) Tblastx – nt trad / nt trad (ESTs)

21 BLAST – programas Query = formato da seq de entrada. BD = formato das seqs do BD. nt (trad) = seq em nt traduzida pelo programa. Compara = o que é comparado, nucleotídeos (nt) ou aminoácidos (aa). Programa = um dos cinco principais tipos de blast.

22 BLAST – query = nts Vs. Nt –MEGABLAST – identificar a seq –Blastn – identificar a seq ou encontrar similares –Tblastx – comparação por proteínas (nts trad) Vs. Prot –Blastx – comparação com proteínas (nts trad) Pequenas seqs de nt –“Search for short, nearly exact matches” – busca para primers ou motivos

23 BLAST – query = aas Vs. Prot –Blastp - identificar a seq ou encontrar similares –PSI-Blast – encontrar membros da família da proteína ou genes muito distantes –PHI-Blast – busca similaridade de seq + padrão Domínios conservados –CD-search – encontra no query –CDART – encontra no query e busca outras

24 BLAST – query = aas Vs. Nt –Tblastn – busca proteínas similares Pequenas seqs de proteínas –“Search for short, nearly exact matches” – busca para motivos Especializadas (nt ou prot) –Blast 2 sequences –BDs específicos (genomas etc.)

25 BLAST – resultado Query / Subject “Low score filter” Gráfico Lista de alinhamentos –“Score” e “E value” Alinhamentos –Identidades (matchs) –Positivos –Posições de início e fim

26 BLAST – resultado Escolher BD

27 BLAST – resultado Domínio encontrado ID facilita busca ERRO!!

28 BLAST – resultado

29 Link

30 1 subject query BLAST – resultado 71 164 134

31 5. Interface de anotação Eduardo Fernandes Formighieri Laboratório de Genômica e Expressão / UNICAMP Fevereiro - 2006

32 Interface de anotação http://www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura http://www.lge.ibi.unicamp.br/cgi- bin/proj_anot/Vassoura_ESTs_Mic3/contigs_usuarios.cgi