BRUNO LEONARDO DE FREITAS SOARES EFEITOS DO ALPROSTADIL NA SÍNDROME DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO EM TECIDO RENAL DE RATOS São Paulo 2004 Projeto de Tese apresentado à Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em Ciências

1. Introdução 1.1 - Contexto Descrição de síndrome associada a extensas lesões musculares traumáticas (Bywaters EGL ,1941) 1 Síndrome metabólica pós revascularização (Haimovici H., 1960)2 Síndrome mionefropática ou de reperfusão (Haimovici H., 1973)3 O nível de obstrução e a massa muscular envolvida são importantes na síndrome (Francisco Jr, Burihan E.,1982) 4 Pouco progresso no tratamento a despeito do conhecimento5 1. Bywater EGL, Beall D. Crush injuries with impairment of renal function. Br Med Journ, 1:427-32. 2. Haimovici H. Arterial embolism with acute massive ischemic myopathy and myoglobinuria. Surgery 1960; 47: 739-47. 3. Haimovici H. Miopathic nephrotic metabolic syndrome associated with massive acute arterial occlusion. Arch Surg 1999 nov; 18(5): 439-44. 4. Francisco JR, Burihan E. Tratamento das embolias aorto-iliacas. Revista de tema livre do 16 Congresso Brasileiro de Cirurgia 1982; p.79. 5. Ward MH. Factors predictive of acute renal failure in rhabomyolysis. Arch Int Med 1988; 148: 1553-7.

1.1- Contexto Injúria renal decorre da magnitude e da duração da isquemia (Myers, 1986)6 A isquemia leva ao edema intersticial com obstrução tubular e necrose tubular aguda6,7,8 6. Myers BD, Mran SM. Hemodinamically mediated acute renal failure. N Eng J Med 1986;314:97. 7. Joves DB. Ultrastructure of acute renal failure. Lab Invest 1982;46:254. 8. Brezis M, Rosen S, Epstein FH. Renal ischemia: a new perspective. Kidney Int 1984;26:275.

1.1- Contexto Molécula de adesão intercelular tipo 1 (ICAM1) 24,25,26,27,28 Mecanismo direto e indireto de lesão celular 18,19,29,30 Radicais livres de oxigênio e lesão celular 29 Efeito atenuante da PGE1 no tecido isquêmico renal reperfundido em ratos 38, 24. Rothein R, Dustin ML, Marlin SD, Springer TA. A human intercellular adhesion molecule (ICAM-1) distinct of LFA-1. J Immunnol 1986;137:1270-8. 25. Diamond MS, Stauton DE, Fougeroller R, Stackers S, Garcia J, Hibbs ML et Al. ICAM-1 (CD54): a counter-receptor for Mac-1(CD11/CD18). J Cell Biol 1990;111(part2):3219-39. 26. Denton MD, Marsden PA, Luscinkas FW, Brenner BM, Brady HR. Cytokine-induced phagocyte adhesion to human mesangial cells: role of CD11/CD18 integrins and ICAM-1. Amm J Phisiol 1991:261(part2):1071-9. 27. Kelly KJ, Williams JR, Colvin RB, Bonventre JV. Antibody to intercellular adhesion molecule 1 deficient mice are protected against ischemic renal injury. J Clin Invest 1996;97:1056-63. 28. Kelly KJ, Williams JR, Colvin RB, Bonventre JV. Antibody to intercellular adhesion molecule 1 deficient mice are protected against ischemic renal injury. Proceedings of the Natinal Academic of Sciences, USA 1994;91:812-6. 29. Granger DN. Role of Xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol 1988;225:1269-75. 30. Ascer E, Mohan C. Skeletal muscle ischemic reperfusion. Pathophysiology and therapeutic intervention. In F.J. Current critical problems in vascular surgery. Saint Louis, Quality medical Publish 1994;V6.

1.1- Contexto Alprostadil: análogo da prostaglandina (PGE1) Bloqueio de substâncias quimioatrativas Diminuição da adesividade leucocitária Diminuição da expressão das moléculas ICAM-1 Diminuição da resistência vascular periférica 34,37,38,39 34. Lindermann S, Gierer C, Darius H. Prostacyclin inhibits adhesion of polymorphonuclear leukocytes to human vascular endothelial cells due to adhesion molecule independent regulatory mechanisms. Basic Res Cardiol 2003 Feb;98(1)8-15. 37. Gupta PC, Matsushita M, Oda K, Nishikimi N, Sakurai T, Nemura Y. Attenuation of renal ischemia-reperfusion injury in rats by alloprurinol and prostaglandin E1. Eur Surg Res 1998;30(2):102-7. 38. Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Prostaglandin E1 attenuation of ischemic renal reperfusion injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6):713-7. 39. Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Prostaglandin E1 attenuation of ischemic renal reperfusion injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6):713-7

1.2- Hipótese O uso do alprostadil, por via intravenosa, atenua o efeito das lesões metabólicas e histológicas e imuno-histoquímicas na isquemia e reperfusão em tecido renal de ratos

1.3- Objetivo Avaliar os efeitos da infusão intravenosa do alprostadil num modelo experimental de isquemia e reperfusão em tecido renal de ratos

2. Métodos 2.1-Tipo de estudo - Ensaio clínico aleatório em animais de experimentação 2.2-Local 2.2.1-Laboratório do Departamento de Cirurgia Experimental e Técnica Operatória - FMSP-BA

2. Métodos 2.3 –Amostra 2.3.1 – Amostragem 30 ratos machos Linhagem OUT B Wistar Idade - 90 a 120 dias Peso - 250 a 350 g 15 dias - observação e adaptação Condições controladas 2.3.1 – Amostragem Animais provenientes do biotério do Departamento de Cirurgia Experimental e Técnica Operatória da FMSP-BA

2. Métodos 2.4 Procedimentos 2.4.1 - Grupos experimentais Grupo I (10 animais ) – Grupo Sham, sem isquemia ou reperfusão. Infusão de Solução salina (Sf 0,9%) atráves jugular externa (V.J.E) após 1h e 30 minutos de procedimento. Grupo II ( 10 animais ) – Procedimento microcirúrgico normal, 30 minutos de isquemia (clampeamento) e 1h de reperfusão . Infusão de SF 0,9% antes da reperfusão. (V.J.E.) Grupo III ( 10 animais ) – Procedimeto idêntico ao Grupo II, exceto pela infusão de aproximadamente 20microgramas/kg Alprostadil, antes do desclampeamento. (V.J.E.)

2. Métodos 2.4.2 - Randomização 2.4 Procedimentos - Envelopes - Sorteio aleatório - Examinadores

2.4 Procedimentos 2.4.3 Modelo experimental Pré operatório Serão submetidos a jejum (6h) Serão pesados Sorteados Anestesia Fenobarbital sódico (30mg/kg) via intraperitoneal Sono profundo Estímulos dolorosos irresponsivos Doses complementares de anestésico

2.4- Procedimentos 2.4.3- Modelo Experimental Dissecção, isolamento e cateterização da veia jugular externa Tricotomia ventral abdominal com lâmina de barbear Incisão abdominal mediana com 5cm Abordagem transperitoneal da aorta, com isolamento do segmento abdominal até acima das artérias renais Oclusão da aorta supra-renal por 30 minutos Liberação do clampe e reperfusão 1 h (GII, GIII) Solução salina (GII) e Alprostadil (GIII), antes da reperfusão GI - Sham Amostras de sangue Nefrectomia esquerda e preparo das peças Eutanásia – dose anestésica letal

2.4 Procedimentos 2.4.3 Modelo experimental Estudo Imunohistoquímico (Laboratório de biologia molecular da Fiocruz-Salvador) Amostras de Tecido Renal Estudo histológico (microscopia ótica) Tricromio Gomori modificado Hematoxilina eosina Azul patente (Azul de Alcion) Impregnação argêntica

2.5.1- Variáveis primárias 2.5.1.1- Estudo imuno-histoquímico Dosagem de Molécula de adesão intercelular do tipo 1 (ICAM-1) Dosagem de Mieloperoxidase Análise qualitativa de desarranjo estrutural

2.5.1- Variáveis primárias 2.5.1.2- Estudo histológico Presença de infiltrado inflamatório agudo Presença de necrose Apoptose Edema celular e intersticial

2.5.2 Variáveis secundárias 2.5.2.1- Avaliação bioquímica sérica Desidrogenase lática  Leucometria Creatina fosfoquinase  Potássio Lactato  Hemogasimetria Uréia Sódio Creatinina Cálcio

2.6- Modelo Estatístico 2.6.1- Cálculo do tamanho da amostra 2.6.2- Análise estatística Análise de variância por postos de Kruskal Wallis (Siegel, 1988) Teste de Mann-Whitney para duas amostras independentes (Siegel, 1988) P = 0,05 ou 5% Nível de rejeição da hipótese de nulidade