Malárias humanas Plasmodium

Taxonomia dos plasmódios reino filo subfilo classe ordem subordem gênero e espécie Protozoa Apicomplexa Sporozoa Coccidia Eucoccidiida Haemosporina Plasmodiidae Plasmodium vivax P. falciparum P. ovale P. malariae P. knowlesi Vetor e hospedeiro definitivo: Anopheles spec. Na África: Anopheles gambiae No Brasíl: Anopheles darlingii

Malária e Plasmodium : Dados históricos -Dizimou as populações desde o começo da civilização (“Mal ar”) -Parasita foi decoberto por Laveran (1880), Golgi descreveu em 1885 a esquizogonia eritrocítica, Pfeiffer reconheceu a relação biológica dos plasmódios com os outros coccídeos Manson sugeriu a transmissão vetorial que Ross comprovou em 1898. Grassi demonstrou que somente a fêmea dos Anofelinos transmite os plasmódios A fase hepática da infecção foi comprovada somente em 1948 por Shortt e colegas, forma hepática visualizada nos anos 80 Foi erradicada na Europa somente depois da segunda guerra mundial - A transmissão pode se espalhar para áreas antes não acometidas com o aquecimento global, migrações e invasão de áreas florestais sem políticas públicas de prevenção

Distribuição da Malaria (Guerra et al. 2008) 1946

Distribuição da Malaria (Guerra et al. 2008) 2007

Casos de malária no Brasil vs. espécie (1970 a 2009) Aproximadamente 75% P.vivax. Número de casos ( x 1000) Agora, se a gente considerar o numero de casos de malaria no Brasil por especie de Plasmodium, a gente observa que atualmente a maioria dos casos é causada pelo P vivax. De fato, aprox. 75% dos casos ocorridos na Amazonia são causados pelo P vivax. Fonte de dados: SISMAL e SIVEP-Malária, excluídas LVC

Ciclo de vida do parasita Fase hepática Fase hepática Inseto Ciclo eritrocitário Ciclo eritrocítico

A infecção Kappe et al. TIP 2003

Movimento de esporozoitas na pele Invasão de vasos sangüíneos

Esporozoítas invadem células de duas maneiras: - invasão temporária - invasão definitiva CD81 Kappe et al. TIP 2003 O contato com citossol de células é necessário para capacitar os esporozoitas à invasão definitiva da célula hepática

O desenvolvimento do esporozoíta na célula hepática ocorre dentro do vacúolo parasitóforo Dia 1 pós infecção CK CK Fluxo sangüíneo

O esporozoita se divide em um processo especial de divisão celular: a esquizogonia Dia 3 pós infecção

Dia 5 pós infecção

Após 7-10 dias, a célula hepática morre e libera Sturm et al. 2006, Science 313, p 1287f Após 7-10 dias, a célula hepática morre e libera 20.000-40.000 merozoítas empacotados em “merossomos” ao fluxo sangüíneo

? Esporozoítas de Plasmodium vivax e ovale podem não entrar em multiplicação mas ficar por semanas/meses e raramente anos em estágio dormente (hipnozoíta) ? Dia 1 dia 48 dia 221 dia 225

O merozoíta Bannister et al. TIP

- A invasão da hemácia é facilitada pela secreção de enzimas contidas na róptria e nas micronemas - A interação firme/invasão depende de proteínas da superfície do merozoíta e da hemácia: P. vivax: Duffy binding protein 1 e 2 e fator Duffy* SOMENTE P. falciparum: EBA-175 (e parálogas), RH5 e glicoforinas, Basigina, respectivamente Hemácias de Negros não possuem o fator Duffy! Por isso pouco P. vivax na África (vantagem evolutiva)

O ciclo sangüíneo começa com a forma “anel” do parasita (P. falciparum : 2~12 horas após infecção), dentro de um vacúolo Bannister et al. TIP

No trofozoíta, o DNA começa a ser replicado e a hemácia infectada profundamente reestruturada (instalação de um sistema de secreção no citossol da hemácia), pigmento (heme polimerizado) é acumulado (14~36 h)

- Durante o crescimento do plasmódio, hemoglobina da hemácia é metabolizada para fornecimento de energia e metabolitos e para manter a pressão osmótica hemoglobina ------> aminoácidos + heme--> polímero (hemozoína) energia e/ou síntese protéica do plasmódio www.vtnews.vt.edu

No esquizonte, começa a formação de novos merozoítas (36-46 h) Bannister et al. TIP 2000

A liberação dos merozoítas ocorre em dois passos mediados por proteases diferentes do plasmódio Ruptura do vacúolo parasitóforo Ruptura da hemacia

Durante o ciclo sangüíneo alguns parasitas se desenvolvem para formas sexuadas (Gamontogonia-> gametócitos)

Eventualmente, o indivíduo infectado vai para um criadouro de Anofelinos...

...e vira “jantar”

Vetores e não-vetores de Plasmodium vivax e falciparum Anopheles gambiae Anopheles darlingi

Membrana peritrófica 2n

Penetração do oocineto pela matriz peritrófica é mediada por quitinases do plasmódio sangue microvilosidades OOCINETO MATRIZ PERITRÓFICA Trends in Parasitol 17:269-272, 2001 Se o parasita não sair da matriz peritrófica, é eliminado

Se o pernilongo melanizar esta célula antes da hora, a infecção é eliminada “Time bomb model” Lumen intestinal 2n R! 2n hemolinfa

Oocistos de Plasmodium gallinaceum SEM

Esporogonia

Lumen intestinal hemolinfa Interação receptor-ligante, MAEBL + CS + proteina Saglina O “estouro” dos oocistos é assincrônico, do gametócito até o esporozoita na glândula salivaria demora 8-15 dias

~14 dias depois, um outro indivíduo vai para um criadouro de Anofelinos...

...e é picado

! Não é zoonose Fatores importantes na transmissão - vetores competentes - condições ecológicos apropriados para os vetores - temperatura média acima 16-20°C - indivíduos infectados (-> fonte de gametócitos!) ! P. falciparum : A parasitemia tem que ser mantida em indivíduos infectados Não é zoonose

Curva de Parasitemia e febre de um paciente não-immune (Staalsoe e Hviid, Parasitology Today 1998) ---> Aquisição da imunidade protetora mas não esterilizante demora em torno de 5-10 anos

O que é uma resposta protetora encontrada em pessoas da área endémica? - Imunidade estéril naturalmente muito rara ou inexistente Resposta humoral: Anticorpos contra determinados antígenos do merozoita: MSP1, MSP3, GLURP, EBA175 e outros, subclasses citofílicos de anticorpos Associação não muito clara com o tipo da resposta Th1/Th2 Resposta células T plus IFN contra antígenos do estágio hepático - Anticorpos contra a superfície da hemácia infectada (PfEMP1, RIFIN, e outros)

Estratégias do plasmódio de evitar/modular a resposta imunológica do hospedeiro - crescimento intracelular em células com pouco ou sem apresentação em MHC1 - Não deixar a hemácia infectada passar pelo baço: citoaderência (apenas P. falciparum) e variação antigênica interferência imunológica: anergia, inibição da resposta celular contra estágios sanguineos (o parasita não é eliminado por completo), o sistema imunológico deixa de reagir ao parasita (parecido com cancer – exaustão clonal)

Plasmodium falciparum: Formas maduras não se encontram no fluxo sanguíneo

Hemácias infectadas com formas >20 h após reinvasão tem protrusões (“knobs”)

Proteínas no knobs (PfEMP1s) se ligam a receptores em células endoteliais Capillary endothelial cells baço

As proteínas associadas as knobs e responsáveis pela citoaderência possuem domínios altamente variáveis, mas as regiões responsáveis pela ligação são conservadas, porém, parecem pouco imunogênicas PfEMP1 Superficie do knob

- Por genoma de Plasmodium falciparum, existem ca. 50 cópias diferentes de genes que codificam para PfEMP1s - Somente uma espécie de PfEMP1 é expressa por hemácia infectada (exclusão alélica transcripcional) - A expressão das PfEMPs varia em torno de 2% por ciclo sangüíneo 4 98 + 2

Aspectos clínicos: A malária Sintomas da infecção com Plasmodium spec. em pessoas não-imunes febre cefaléia sudorese artralgia mialgia calafrios frequente: febre intermitente as vezes: esplenomegalia diarréia, vômitos anemia

Malaria grave: Somente em infecções com P. falciparum: - malaria cerebral - anemia grave - insuficiência renal síndrome pulmonar Malaria gestacional devido a: grande acúmulo de substâncias tóxicas, citoaderência de hemácias infectadas, tendo como consequência suboxigenação de determinados orgãos

Markell´s and Voge´s Medical Parasitology

Diagnose da malária -> Detecção e discriminação de formas sangüíneas - Esfregaço de sangue, corado com corante Giemsa (quando tem muitos parasitas: >0,1% parasitemia) - Gota espessa, corado com Giemsa (quando tem poucos parasitas, <0,1% parasitemia) - QBC (quantitative buffy coat) - “Dip stick” tests, detectam antígenos maláricos circulantes (no campo): Histidin rich protein

Técnica de QBC Luz UV

A identificação da espécie de Plasmodium em sangue de infectados requer treinamento de microscopistas P. vivax P. falciparum

Terapia da Malaria O diagnóstico da espécie infectante é essêncial! O tratamento deve ser supervisionado SEMPRE por um médico. É necessário considerar quais estágios devem ser combatidos (Hipnozoítas, gametócitos, trofozoitas) Trofozoitas : Quinina, Cloroquina, Mefloquina, Halofantrin, Pyrimethamin, Tetraciclina, Doxiciclina, Artemisinina e derivados Estágios hepáticos: Primaquina, Proguanil, Tetraciclinas Gametócitos : Primaquina, Cloroquina, Amodiaquina Terapia de P. vivax : Cloroquina plus Primaquina Terapia de P. falciparum : Quinina + Tetraciclina ou Artemisinina + Amodiaquina Artemisinina + Lumefantrina (Coartem) Cloroquina não exerce mais nenhum efeito contra P. falciparum

“Balas de prata” perdidas para terapia de P. falciparum Fansidar (pirimetamina + sulfadoxina) Cloroquina Terapéuticos com relatos de função parcial Mefloquina, quinina, amodiaquina, primaquina...(todos os lugares) Artemisinina (Venezuela, Cambodia)

Atualmente existem poucas drogas contra as quais não existe alguma resistência Cloroquina foi perdida para terapia de P. falciparum Resistências variadas contra diversas drogas complicam o tratamento (follow-up necessário) Novas drogas derivados de Vitamin B (“suicide drugs”) Inibidores da síntese de lipídeos Outras drogas que inibem a síntese de poliprenóides

Profilaxia - Quimoprofilaxia é possível mas deve ser limitada a casos emergenciais (pessoas splenoectomizadas) - Usar repelente quando possível, uso de mosquiteiros impregnados com piretroides Uso de luvas no tratamento cirúrgico de maláricos Teste de contaminação de conservas em bancos de sangue - tratar os assintomáticos - Medidas ambientais - tratar igarapés com óleo (larvacido), ou criar tilápias para combater procriação de anofelinos - desmatar o terreno ao redor de moradias

Vacinas contra Malária from Good & Doolan 1998

Vacinas contra Malaria - Esporozoítas irradiadas (imunidade estéril) Revés: formas sangüíneas parecem interferir com esta resposta protetora, curta duração, logisticamente difícil - vacinas recombinantes baseadas em antígenos do esporozoita e merozoita (anti-pre-eritrocítico e anti-formas sangüineas) Revés: Mutações e recombinações podem levar a escape imunológico, variantes locais - vacinas contra antígenos dos gametas ou gametócitos (anti-transmissão) (- vacinas anti-aderentes contra formas graves da infecção com P. falciparum?) - Esporozoítas transgênicos que não se desenvolvem para formas sanguíneas

Novas aproximações são perseguidas Genoma de P. falciparum, Anopheles gambiae e Homo sapiens publicado em 2002 1. Transcriptoma e proteoma de P. falciparum em cultivo publicado em 2003 plasmodb.org: vários proteomas, transcriptomas, genomas Uma politica eficiente para África onde morre a maioria das pessoas infectadas é urgente 90% dos casos de malária acontecem na área subsaariana e a maioria de 800.000 de mortes são de crianças com menos de 5 anos

Literatura: Markell´s & Voge´s Medical Parasitology L. Rey: Parasitologia Diversos Reviews ao longo dos anos em Trends in Parasitology, Nature, Science http://plasmodb.org

Perguntas / Take home message Qual forma infecta naturalmente o hospedeiro intermediário e por qual via? Como o parasita (merozoita) consegue sair da célula hepática infectada sem ser fagocitado por células Kupffer (macrófagos)? Por que não podemos ver formas maduras do parasita sanguíneo em sangue de pessoas infectadas com P. falciparum ? Por que é necessário tomar primaquina ou tafenoquina quando infectado com P. vivax ? O que é necessário para desencadear uma epidemia de malaria?

Toxoplasmose e Toxoplasma gondii

O parasita:Toxoplasma gondii Parasita intracelular obrigatório, capaz de infectar diversos tipos de tecidos e hospedeiros. Descoberto em 1908 por Nicolle e Manceaux em um roedor do Norte da África denominado “gundi“. Em 1923 a transmissão congenital foi descrita, e um teste diagnóstico estabelecido por Albert Sabin e Henry Feldmann, comprovou que a infecção com T. gondii é muito comum Em 1956 foi postulado que a infecção seria por ingestão de carne crua infectada com cistos, comprovado em 1965. O ciclo de vida completo foi descoberto somente em 1970.

Filo Apicomplexa Classe Sporozoa Subclasse Coccidia Ordem Eucoccidiida Família Sarcocystidae Apicoplasto

Cisto tecidual

Genoma de 80 Mb distribuido em vários cromossomos de 2-6 Mb, organismo predominantemente haploide. Genoma mitocondrial de 6 kb e do apicoplasto de 35 kb Geneticamente accessivel por transfecção de plasmídeos com diferentes marcadores de resistência, por isso as vezes utilizado como organismo modelo para Plasmodium Três cepas diferentes existem em circulação, somente cepa I é virulento em seres humanos

Ciclo de vida No ser humano existem tachizoitas e bradizoitas

A locomoção e invasão é ativa e depende de um “motor“ actina-miosina e proteinas parecidas com trombospondina na superfície (Opitz e Soldati, 2002)

A passagem de T. gondii por celulas não interfere com a viabilidade das células e não influi na infectividade do tachizoita ao contrário do que acontece com esporozoitas de Plasmodium

Dentro da célula hospedeira, o tachizoito se desenvolve dentro de um vacúolo parasitóforo com o qual não ocorre fusão com lisossomos

Interação parasita-hospedeiro: Como reage o hospedeiro ao parasita? T (CD8+) IFNg, IL2 1. Resposta celular NK IFNg T NO OH. IL12 MF PQ (Tromboxano)

2. Resposta humoral (Antígenos reconhecidos: SAG1, proteinas MIC etc.) IgG, IgM, IgA e IgE, complemento lisa tachizoitos na presença de anticorpos específicos

3. Controle de formas bradizoitos em cistos - O rompimento ou não da parede do cisto parece depender do nivel de IFNg e NO No caso de imunossupressão bradizoitas se transformam em tachizoitos novamente! Mensageiro: Acido abscisico

A resposta é diferente em lugares diferentes Cerebro (dados de estudos em camundongos) Células T possivelmente se ligam a receptores endoteliais antes da extravasão Antigeno de parasitas é apresentado por células glia e celulas T são ativadas para secretar IFNg Microglia e astrócitos participam na destruição do parasita e de células infectadas

Olhos Normalmente, o liquido intra-ocular contém imunosupressores Tachizoitos e cistos são encontrados na neuroretina e no epitélio pigmentado da retina IFNg e TNFa plus NO parecem limitar a infecção ao menos no camundongo

Patogenia da infecção com Toxoplasma gondii Em imunocompetentes, infecção passa despercebida. 10-20% dos pacientes podem desenvolver linfoadenopatia cervical e/ou um quadro semelhante a uma virose pela multiplicação do parasita (destruição de tecido e pequenas necroses), raramente ocorre hepatite, pneumonite e retinocoroidite. Sobram calcificações e bradicistos. A presença do parasita pode causar neuro-disturbios complexos, as vezes sutis – difícil de comprovar Em imuno-suprimidos (pacientes com transplantes, aidéticos), infecções latentes são reativadas e levam em 25-50% dos casos a encefalite (90% letal se não tratado), convulsões, efeitos neurologicos, as vezes miocardite.

Em fetos, pode ocorrer a disseminação desenfreada do parasita e destruição em massa de tecidos e calcificação. Sequelas do feto são no caso da primi-infecção de gravidas no primeiro trimestre (observados após o parto): morte/aborto 10% encefalite, hidrocefalite, microcefalite ou retinocoroidite e calcificações 30% não se infectam 50-60%

Patologia da infecção com Toxoplasma gondii retinocoroidite hidrocefalo Fase aguda Fase crônica Roberts & McLeod, Parasitology Today 1999

Diagnóstico 1. Clínico: sintomas - Diagnóstico clínico do adulto quase impossível - Diagnóstico no imunosuprimido e neonatal é sugestivo, mas tem que ser confirmado pela detecção do parasita 2. Parasitológico: a partir de material de biópsias - coloração com Giemsa - inoculação intraperitoneal ou intracerebral em camundongos suscetíveis (Balb/C), depois biópsias - inoculação de cultura de fibroblastos, formação de plaques após poucos dias

3. Imunológico/molecular ELISA específico detectando IgG ou IgM em soro de pacientes Imunofluorescência direta e indireta Por PCR 4. Por exame neurológico visualizando lesões cerebrais por tomografia computadorizada ou ressonância magnética

Epidemiologia Parasita quase perfeito: Aprox. 70% dos seres humanos tiveram contato com T. gondii Alta incidência em paises com hábitos de comer carne crua (infecção com bradicistos!): França 96%, Alemanha 70%, no Brasil, 50-80% (L. Rey) Gatos domésticos são uma fonte importante de oocistos: 2-20 milhões de oocistos por gato infectado são eliminados diariamente! A infecção do gato pode durar até um ano. O oocisto mantém se viável por 1 a 1 ½ anos Esporadicamente ocorrem contaminações com oocistos pela água que podem levar a epidemias locais

7 dias mais tarde...

Controle Precauções extraordinárias devem ser tomadas com mulheres grávidas ainda não infectadas Cozinhar/grelhar bem carne antes de comer Bradicistos são inativados em carne por congelamento de mais que três dias a –20°C Limitar a circulação de gatos a lugares ondem brincam crianças (caixa de areia!) Uso/troca frequente de luvas no atendimento

Tratamento Indicado somente para casos graves e mulheres grávidas, a infecção de adultos imuncompetentes não necessita terapia O objetivo do tratamento é duplo: Eliminar o parasita Abrandar reações aversas da resposta imunológica para conter destruição de tecidos nobres

Tratamento clássico: Pirimetamina-Sulfadiazina Dose inicial de 75 mg Pirimetamina, depois 25 mg per diem PLUS Dose inicial de 2 g Sulfadiazina, depois 1 g per diem durante 4-6 semanas Alternativamente: Clindamicina 300 mg per diem plus sulfadiazina durante 4-6 semanas Alternativamente: Tetraciclina Dose inical 2 g, depois 250 mg plus sulfadiazina durante 4-6 semanas Todos tem efeitos colaterais, folato deve ser administrado para conter efeitos da Pirimetamina na medula óssea

Tratamento imunossupressivo - Esteroides/corticoides 20-80 mg por dia após o começo da terapia com antibióticos Não aplicar esteroides perioculares NUNCA aplicar esteroides SEM terapia com antibióticos

Vacinas? Objetivo é: Inibir infecção inicial (IgA na mucosa intestinal) Inibir infecção geral (resposta celular Th1) Inibir infecção transplacentar (IgG) “Gold Standard“ e imunização com T. gondii cepa S48

GM Bhopale, 2003 Microbes and Infection

Leitura citada e recomendada: Internet: Artigos encontrados no PubMed procurando por: Toxoplasma gondii + vaccines Toxoplasma gondii + retinochoroiditis Toxoplasma gondii + pathology Livros: Luis Rey: Parasitologia Markell, John, Krotoski: Medical Parasitology

Citoaderência/intenso contato de hemácias infectadas em células dendríticas pode levar a anergia das mesmas DC Células T (CD8+) específicas para peptídeos plasmodiais apresentados em MHC1 de células hepáticas são inibidas por estas células dendríticas