XVIII Exposição de Experiências Municipais em Saneamento De 4 a 9 de maio de 2014 - Uberlândia - MG   IMPLANTAÇÃO DE UMA METODOLOGIA DE ANÁLISE DE Giardia E Cryptosporidium EM UMA ESTAÇÃO DE TRATAMENTO DE ÁGUA Ivan Canale Antonio Carlos Ferreira Felipe Augusto Gasparotto SEMAE – Piracicaba-SP

Protozoários Emergentes: Giardia e Cryptosporidium Protozoários: grupo de microrganismos; vida livre ou parasitas; alguns patogênicos. Giardia spp. e Cryptosporidium spp.: protozoários patogênicos veiculados pela água contaminada. Contaminação: ingestão de água contaminada; preparo de alimentos com água contaminada; contato recreacional ou profissional. ETA de ciclo completo: processos de coagulação-floculação-decantação e filtração são as principais barreiras para remoção de cistos e oocistos de protozoários; tais organismos são resistentes à cloração realizada nas ETAs.

Giardia spp. – Trofozoíto (a) e cisto (b) Fonte: Karanis, 2011.

Giardia spp. – cisto (RID)

Cryptosporidium spp. - oocisto Fonte: Cantusio Neto, 2008.

Presença de protozoários em mananciais de abastecimento Descarga de esgotos domésticos tratados ou não tratados e o lançamento de efluentes contendo fezes de animais podem contaminar os mananciais superficiais utilizados para abastecimento público com (oo)cistos (KARANIS, 2011); Grau e o tipo de ocupação da bacia hidrográfica, a existência de cobertura vegetal e a pluviosidade como fatores que contribuem para a ocorrência de (oo)cistos nos mananciais (LeCHEVALLIER; NORTON; LEE, 1991; ATHERHOLT et al., 1998; KISTEMANN et al., 2002; BASTOS et al., 2004; HACHICH, et al., 2004; DIAS, et al., 2008).

Presença de protozoários em mananciais da região de Piracicaba Cantusio Neto (2004): Rio Atibaia – Giardia (0 a 94,5 cistos/L); ausência de Cryptosporidium. Oliveira (2005): Rio Atibaia (50 amostras analisadas) – presença de Giardia em mais de 50% das amostras analisadas; presença de Cryptosporidium em uma amostra. Monitoramento da CETESB (2001, 2002, 2003): Rio Piracicaba: grande número de resultados positivos para Giardia (0 – 153 cistos/L); em 2002, 11 coletas, 36% resultados positivos para Cryptosporidium (0,1 a 0,6 oocistos/L). CETESB: Rio Corumbataí - presença de Giardia em novembro de 2001 (0,8 cistos/L) e setembro de 2002 (6,9 cistos/L); ausência de Cryptosporidium.

Portaria 2914/2011 do Ministério da Saúde e o monitoramento de protozoários Art. 31, § 1º: “quando for identificada média geométrica anual maior que 1000 Escherichia coli/100 mL, deve-se realizar monitoramento de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. no(s) ponto(s) de captação de água”. Art. 31, § 2º: “quando a média aritmética da concentração de oocistos de Cryptosporidium spp. for maior ou igual a 3,0 oocistos/L no(s) pontos(s) de captação de água, recomenda-se a obtenção de efluente em filtração rápida com valor de turbidez menor ou igual a 0,3 uT em 95% (noventa e cinco por cento) das amostras mensais ou uso de processo de desinfecção que comprovadamente alcance a mesma eficiência de remoção de oocistos de Cryptosporidium spp”.

Portaria 2914/2011 do Ministério da Saúde e o monitoramento de protozoários Art. 31º, § 4º: “a concentração média de oocistos de Cryptosporidium spp. referida no § 2º deste artigo deve ser calculada considerando um número mínimo de 24 (vinte e quatro) amostras uniformemente coletadas ao longo de um período mínimo de um ano e máximo de dois anos”. A Portaria também estabelece no seu artigo 30º, § 2º o valor máximo permitido (VMP) de 0,5 uT para a água filtrada por filtração rápida (tratamento completo ou filtração direta).

Objetivos O objetivo deste trabalho é relatar a implantação de uma metodologia de monitoramento de Giardia e Cryptosporidium em águas brutas e tratadas pelo Serviço Municipal de Água e Esgoto de Piracicaba – SP – Brasil (SEMAE – Piracicaba), os custos envolvidos nesse processo e os resultados analíticos do monitoramento nos mananciais utilizados para abastecimento público (rios Piracicaba e Corumbataí) e nas ETAs de Piracicaba, durante o ano de 2013.

Técnicas analíticas para detecção de protozoários em amostras de água ETAPAS GERAIS: Concentração da amostra de água, com a finalidade de recuperar ou capturar (oo)cistos; Purificação dos (oo)cistos, com separação dos organismos-alvo de materiais particulados e interferentes presentes na amostra; Detecção por reação de imunofluorescência, identificação e contagem em microscópio. Principais metodologias recomentadas (para concentração da amostra): Floculação com carbonato de cálcio Sistema Filta-Max® Filtração em membranas

Concentração por filtração em membranas (Franco, et. al., 2012) Vantagens: aplicabilidade a amostras de água tratada ou bruta (mesmo amostras de composição físico-química complexa); menor custo e menor tempo de processamento laboratorial; preserva a morfologia dos (oo)cistos. Principal fator limitante: turbidez, que causa a obstrução dos poros da membrana, gerando a necessidade de trocá-la para filtrar toda a amostra.

Filtração da amostra: membrana éster de celulose, 47 mm, 3 ou 1,2 µm. Concentração por filtração em membranas (Franco, et. al., 2012) Raspagem da membrana: Alça plástica estéril; 20 min.; usar solução de eluição (Tween 80 0,1%) Filtração da amostra: membrana éster de celulose, 47 mm, 3 ou 1,2 µm. Água Bruta: 0,3 a 2 litros Água tratada: 15 a 20 litros

Raspagem da membrana (final) Concentração por filtração em membranas (Franco, et. al., 2012) Concentrado no tubo para centrifugação: 1050 xg durante 10 min (realizar este procedimento 2 vezes) Raspagem da membrana (final)

Pellet final no eppendorf: desejável um volume final de 500µL ou menor Concentração por filtração em membranas (Franco, et. al., 2012) Pellet final no eppendorf: desejável um volume final de 500µL ou menor

Microscópio de Imunofluorescência Reação de Imunofluorescência Direta (RID) Kit Merifluor para análise de Cryptosporidium e Giardia: análise de alíquotas de 10µL do pellet Microscópio de Imunofluorescência

Oocisto de Cryptosporidium (RID e DAPI) (USEPA, 2012) Critérios de Positividade Fluorescência verde-maçã brilhante; Ausência de poros ou apêndices; Tamanho e forma compatíveis: 8-18 µm de comprimento / 5 -15 µm de largura e formato oval para cistos de Giardia spp., e 4 - 6 µm de diâmetro, formato esférico e presença (não obrigatória) de sutura para oocistos de Cryptosporidium spp. (CANTUSIO NETO, 2008; USEPA, 2012). Oocisto de Cryptosporidium (RID e DAPI) (USEPA, 2012) Cisto de Giardia (RID e DAPI) (USEPA, 2012)

Treinamento de um técnico em instituição especializada (IB – UNICAMP) Investimento (em R$) para implantação da Metodologia de Filtração em Membrana para Detecção de Giardia e Cryptosporidium em amostras de água Equipamentos Custo Estimado Sistema de Filtração: bomba de pressão positiva 1.500,00 Porta filtro para membrana de 47 mm de diâmetro 1.000,00 Centrífuga de mesa, rotor com swing 6.200,00 Agitador de tubos Vórtex 1.400,00 Microscópio de Imunofluorescência 40.000,00 Reagentes Kit para reação de imunofluorescência direta (Merifluor) 3.000,00 Reagentes para solução de eluição (Tween 80 e Anti-Espumante) Materiais Diversos Membrana de ésteres de celulose, porosidade 3 µm / 1,2 µm 600,00 Placas de petri de plástico 60 x 15 (100 placas) 140,00 Tubos plásticos tipo Falcon para centrífuga (15 mL) – pacote com 40 tubos 50,00 Tubos eppendorf de 1 mL (pacote com 500 unidades) 30,00 Pipetas automáticas e ponteiras (5-100 microlitros) 900,00 Outros pequenos materiais (lamínulas, alças (loop) estéril, pipetas plásticas descartáveis, etc.) 80,00 Treinamento de um técnico em instituição especializada (IB – UNICAMP) Total 56.900,00

Controle de Qualidade Analítica Experimentos Controle Positivos Experimentos Controle Negativos Porcentagem média de recuperação para métodos de análise de Giardia e Cryptosporidium estabelecidos pela USEPA (2005) Porcentagem média de recuperação (%) Desvio Padrão (%) Giardia spp Precisão e recuperação inicial (água destilada) 24 - 100 49 Precisão e recuperação contínua (efeito da matriz) 15 - 118 30 Cryptosporidium spp 55 13 - 111 61

Resultados dos testes de precisão e recuperação em água destilada: número de cistos / oocistos inoculados, recuperados, percentual de recuperação, média e desvio padrão (DP) Nº do Teste Nº de cistos inoculado Nº de cistos recuperado % de recuperação de cistos Nº de oocistos inoculado Nº de oocistos recuperado % de recuperação de oocistos 1 180 50 27,8 900 850 94,4 2 360 100 1800 1150 63,9 3 1100 122,2 4 150 83,3 800 88,8 Média DP 41,675 27,75 92,325 23,93

Controle negativo (2 testes): ausência de cistos e oocistos na lâmina. Resultados dos testes de precisão e recuperação em água bruta de manancial superficial: turbidez da água bruta, número de cistos / oocistos inoculados, recuperados, percentual de recuperação, média e desvio padrão (DP) Nº do Teste Turbidez (NTU) Nº de cistos inoculado Nº de cistos recuperado % de recuperação de cistos Nº de oocistos inoculado Nº de oocistos recuperado % de recuperação de oocistos 1 58,9 180 25 13,9 900 2,8 2 106,0 360 0,00 1800 50 3 11,2 300 166,7 1050 116,7 4 27,6 81 45,0 31 3,4 Média DP 56,4 75,902 31,4 56,851 Controle negativo (2 testes): ausência de cistos e oocistos na lâmina.

Monitoramento da turbidez (NTU), E Monitoramento da turbidez (NTU), E. coli (NMP/100 mL) e protozoários (Giardia – nº de cistos/L e Cryptosporidium - nº de oocistos/L) na água bruta do rio Piracicaba Coleta Turbidez E. coli Giardia Cryptosporidium Janeiro / 2013 173 22.000 ND Fevereiro / 2013 24 13.000 102,6 Março / 2013 241 24.000 Abril / 2013 16 11.000 66,7 Maio / 2013 14 5.000 Junho / 2013 17 8.000 62,5 Julho / 2013 63 17.000 400,0 Agosto / 2013 5 Setembro / 2013 15 285,7 ND: não detectado.

Monitoramento da turbidez (NTU), E Monitoramento da turbidez (NTU), E. coli e protozoários (Giardia – nº de cistos/L e Cryptosporidium - nº de oocistos/L) na água bruta do rio Corumbataí Coleta Turbidez E. coli Giardia Cryptosporidium Janeiro / 2013 58,9 17.000 50,0 ND Fevereiro / 2013 106 5.000 Março / 2013 61 24.000 Abril / 2013 119 3.000 Maio / 2013 11 2.600 Junho / 2013 26 33,3 Julho / 2013 28 19,2 Agosto / 2013 19 1.700 58,8 Setembro / 2013 14 2.300 75,0 ND: não detectado.

Cistos de Giardia isolados em amostras do rio Corumbataí – reação de imunofluorescência direta (arquivo pessoal) A turbidez média da água filtrada foi 0,43 NTU para as amostras da ETA 1 e 0,52 NTU para as amostras da ETA 3. Não foram detectados cistos ou oocistos de protozoários nas amostras de água filtrada avaliadas em ambas as ETAs.

CONSIDERAÇÕES FINAIS Mananciais de abastecimento público no Brasil: poluídos por esgotos domésticos e dejetos animais; Importância do monitoramento de organismos patogênicos (Giardia e Cryptosporidium) pelas estações de tratamento de água para consumo humano (atendimento da Portaria 2914/2011); Metodologias de análises de protozoários: necessidades de investimento ($), treinamento; Técnicas analíticas: variabilidade e baixa reprodutibilidade de resultados; Turbidez da água: um dos principais fatores limitantes (inerente à amostra).

DÚVIDAS E ESCLARECIMENTOS ????

OBRIGADO!!! Contato: SEMAE – Piracicaba Setor de Controle de Qualidade Fone: (19) 3413-1110 / 3421-0415 E-mail: icanalle@semaepiracicaba.sp.gov.br www.semaepiracicaba.sp.gov.br

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APHA/AWWA/WEF. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21 ed., Washington DC, APHA, 2005.   CANTUSIO NETO, R.; FRANCO, R.M.B. Ocorrência de oocistos de Cryptosporidium spp. e cistos de Giardia spp. em diferentes pontos do processo de tratamento de água em Campinas, São Paulo, Brasil. Higiene Alimentar, vol. 18, n. 118, p. 52-59, 2004. COMPANHIA AMBIENTAL DO ESTADO DE SÃO PAULO (CETESB). Relatório de Qualidade das Águas Interiores do Estado de São Paulo 2002, Série Relatórios / Secretaria de Estado do Meio Ambiente, CETESB, São Paulo, 279 p., 2003. COMPANHIA AMBIENTAL DO ESTADO DE SÃO PAULO (CETESB). Relatório de Qualidade das Águas Interiores do Estado de São Paulo 2001, Série Relatórios / Secretaria de Estado do Meio Ambiente, CETESB, São Paulo, 160 p., 2002. COMPANHIA AMBIENTAL DO ESTADO DE SÃO PAULO (CETESB). Relatório de Qualidade das Águas Interiores do Estado de São Paulo 2000, Série Relatórios - CETESB, São Paulo, 138 p., 2001. FRANCO, R.M.B.; HACHICH, E.M.; SATO, M.I.Z.; NAVEIRA, R.M.; SILVA, E.C.; CAMPOS, M.M.C.; CANTUSIO NETO, R.; CERQUEIRA, D.A.; BRANCO, N.; LEAL, D.A.G. Avaliação da performance de metodologias de detecção de Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em água destinada ao consumo humano, para o atendimento às demandas da Vigilância em Saúde Ambiental no Brasil. Epidemiol. Serv. Saúde, Brasília, 21 (2): 233-242, abr-jun 2012. KARANIS, P. Giardia and Cryptosporidium: Occurrence in Water Supplies. In: Encyclopedia of Environmental Health, vol. 2: 946-954, Burlington, Elsevier, 2011. MINISTÉRIO DA SAÚDE - BRASIL - PORTARIA 2914. Dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade. Publicada em 12/12/2011. PADUA, V. L. (coord.) Remoção de microrganismos emergentes e microcontaminantes orgânicos no tratamento de água para consumo humano. Projeto PROSAB, ABES, Rio de Janeiro, p. 74-124, 2009. UNITED STATES ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY (USEPA). Office of Water. Washington DC. Method 1623.1: Cryptosporidium and Giardia in Water by filtration/IMS/FA. EPA-816-R-12-001, January, 2012.