Tradução Modificando o alfabeto molecular Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Tradução em eukarya e prokarya Eventos pós-transcricionais

Processo de síntese de proteínas RNAm contém o código do gene RNAt é o adaptor que liga o mundo do ácido nucléico ao mundo das proteínas RNAr faz parte do ribossomo e contém a enzima que catalisa a ligação entre aminoácidos adjacentes

tRNA é o adaptador de Crick ~60-90bp

Transcrição e processamento do RNAt É transcrito de um gene presente no DNA ... E então processado Contém o código do adaptador

O código genético Tradução in vitro de sequências de poli-nucleotídeos conhecidos Diferenças nas cadeias laterais dos aminoácidos Ribozimas X Enzimas

O código genético é redundante Gamow: 20 aminoácidos devem ser codificados por, pelo menos 3 bases Leu Pro Arg Lis Ile UUA CCU AUU AAA CGG CUG CCG AUA AAG CGA Códon: cada grupo de três nucleotídeos consecutivos

Open reading frame determinação da janela de leitura (ORF) Código não-sobreposto

As seis fases de leitura possíveis 5'3' Frame 1 gaggtctggtttgcaactggggtctctgggaggaggggttaagggtggttgtcagtggcc E V W F A T G V S G R R G - G W L S V A 5'3' Frame 2 R S G L Q L G S L G G G V K G G C Q W 5'3' Frame 3 G L V C N W G L W E E G L R V V V S G 3'5' Frame 1 ggccactgacaaccacccttaacccctcctcccagagaccccagttgcaaaccagacctc G H - Q P P L T P P P R D P S C K P D L 3'5' Frame 2 A T D N H P - P L L P E T P V A N Q T 3'5' Frame 3 P L T T T L N P S S Q R P Q L Q T R P

Pareamento códon-anticódon Pareamento de bases Watson-Crick nas duas primeiras bases do códon 3’-5’ to 5’-3’ (pareamento anti-paralelo)

Bases oscilantes (wooble) A base 3’ do códon é oscilante O contato químico não é perfeito (3D)

Inosina, derivado de Adenina

tRNA contém bases modificadas Processamento do tRNA

Como o aminoácido correto é ligado ao tRNA? Como o tRNA correto é ligado ao aminoácido? Como o código genético funciona molecularmente

tRNA-aminoacil sintetases Ligam o tRNA e o aminoácido Reconhecem o anticódon e carregam o aminoácido correto

Aminoácidos ativados

Ativação do triptofano

Quantas tRNA-aminoacil transferases? Uma por aminoácido? Ou uma por códon? Uma única amino acil tRNA sintetase liga um aminoácido a todos os seus tRNAs

Classes de tRNA aminoacil transferases

Controle da tradução I Afinidade da enzima pelo tRNA disposto no código tRNA errado liga-se lentamente e desliga-se rapidamente A adição do aminoácido ao tRNA incorreto é muito lenta

Controle da tradução II O aminoácido deve se encaixar no sítio sintético da tRNA-aminoacil -sintetase ... e não ao sítio de edição Mecanismo de peneira dupla

(des)Controle da tradução III Não acontece verificação do aminoácido na tradução O controle, portanto, é feito apenas no momento da aminoacilação do tRNA

O congelamento do código genético Conservado em praticamente todos os organismos vivos Maquinaria altamente complexa e eficiente Surgiu uma única vez e todos os organismos vivos hoje são descendentes do organismo onde o código surgiu → adaptação!

Ribossomos

Estrutura 2D e 3D do RNAr

Ribossomos de E. coli

Ribossomos eucarióticos O peso do ribossomo se deve mais ao componente de RNA do que ao componente protéico

Ribosomal components

Reciclagem ribossomal

Sítios ribossomais utilizados na tradução Quatro sítios: um para mRNA e três (sítio A, P e E) para tRNA

Prokarya X Eukarya RNA policistrônico Operon RNA monocistrônico interação entre proteínas que se ligam a cauda poliA e proteínas do Complexo de Iniciação

Iniciação da tradução Procariotos: Shine-delgarno (Ribosome Binding Site) Consenso de Kosak hipótese do “scanning” pelo ribossomo necessidade do 5’ CAP GCCRCCAUGG

Start codon Normalmente codifica metionina

Iniciação da Tradução Fatores de iniciação da tradução IF-1 e IF-3 tRNA carregado formil-metionina

Seleção do tRNA correto Somente se pareia o anti-códon é que... Liga-se também ao rRNA

Complexo de iniciação da tradução mRNA liga à subunidade menor do ribossomo tRNA contendo metionina (formilada) liga-se ao complexo Fatores de iniciação da tradução ajudam Subunidade maior reune-se ao complexo

Sítios peptidil e aminoacil

N-terminal Ribossomo RNA mensageiro A A A U A C H H -OOC – C – N - COH -OOC – C - NH2 R 5´ A A A Ribossomo U A C A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C G U U 3´ 5´ RNA mensageiro

Formação da ligação peptídica -OOC-C-N-COH H H R .. Formação da ligação peptídica -OOC-C-NH2 H R A A A The energy needed to form the peptide bonds between amino acids is supplied by ATP when the amino acids are first linked to their tRNA. U A C A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C G U U

Translocação Requer GTP .. G A A U A C A A A -OOC - C – N – C – C – N -COH H H H R O R Translocação Requer GTP U A C G A A H -OOC – C - NH2 R .. A A A A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C G U U

- - - .. A A A G A A -OOC - C – N – C – C – N-COH H H H R O R H -OOC – C - NH2 R .. G A A A A A A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C G U U

- - - A A A G A A H O H H H H -OOC – C – N – C – C – N – C- C –N -COH R H R O R - - - G A A A A A A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C C A G

Sítios peptidil e aminoacil O ribossomo possui 3 sítios onde cabem moléculas de tRNA O alongamento da tradução Proteínas são geradas do N ao C terminal

Ordem de ligação de aminoácidos

Ligação peptídica

Alongamento da tradução

Alongamento ainda... O alongamento continua até o aparecimento de um códon de parada (stop codon) UAA UAG UGA

O fator de extensão induz Duas pequenas paradas (permite que os tRNAs Incorretamente ligados saiam do ribossomo) Primeira parada é o tempo necessário para a hidrólise de GTP (a hidrólise de GTP é mais Rápida por um par correto Códon-anticódon) 2. A segunda parada ocorre entre a dissociação de EF-Tu e a acomodação total do tRNA no sítio A do ribossomo

Terminação da Tradução Fator de terminação liga-se ao stop codon UAA, UGA, UAG Proteína é liberada Complexo é desfeito

Releasing factor

Tradução em procariotos http://www.biostudio.com/demo_freeman_protein_synthesis.htm http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072437316/student_view0/chapter15/animations.html# Tradução em eucariotos http://207.207.4.198/pub/flash/26/transmenu_s.swf

Tempo de execução do processo

Possíveis erros no processo Erro na tradução Proteína incorretamente produzida Dano metabólico

Frameshift Alteração da fase de leitura (frame) tRNAs específicos passam pelo stop-codon 4 bases lidas como 3 Ultrapassa um códon de terminação Produção de proteínas fundidas

Chaperonas I Complexo protéico que auxilia na montagem da estrutura 3D de uma proteína

Chaperonas II

Modificações pós-traducionais Formação de ligações dissulfeto/dobramento Clivagem da cadeia Fosforilação Glicosilação Metilação/Acetilação Adição de âncoras lipídicas Regulação da função protéica

Proteína Pronta! E agora? Destinos possíveis...

Endereçamento de proteínas I - Co-traducional (vias de secreção): ER Golgi Membrana plasmática Meio extracelular II- pos-traducional: núcleo mitocôndria cloroplasto Lisossomos/peroxissomos Sinais de endereçamento na Proteína: 1- Seqüência sinal (16-30 aminoácidos no N-terminal) 2- Sinal de endereçamento nuclear ( 4-8 aminoácidos com carga positiva, ex.: PKKKRLV) 3- Sinal de retenção no RE (KDEL)

Proteínas organelares Produzidas com sinal de exportação Sinal é clivado quando a proteína alcança seu destino celular

Proteínas transmembrana Domínios hidrofóbicos são capazes de invadir as regiões lipídicas (também hidrofóbicas) da membrana plasmática

Inibidores de síntese protéica Antibióticos inibem a síntese de proteínas bacteriana Tetraciclina Liga no RNA 16S (sub 30S) Inibe a ligação do amino- acyl tRNA no sítio A Cloranfenicol Liga na subunidade 50S

Conclusões Tradução é o processo de produção de proteínas A regulação ocorre principalmente na transcrição Modificações pós-traducionais são importantes para regular a função protéica Diferentes tipos de RNAs e proteínas atuam no processo A tRNA aminoacil sintetase é a protéina responsável pelo código genético A última molécula a se juntar ao complexo de iniciação é a subunidade maior do ribossomo As proteínas normalmente começam com o aminoácido metionina A tradução continua até que haja um stop codon As proteínas precisam ter uma conformação 3D correta pra funcionar (chaperonas ajudam na montagem) Muitas proteínas contêm sinais de sinalização celular