Universidade de São Paulo Instituto de Ciências Biomédicas Depto Universidade de São Paulo Instituto de Ciências Biomédicas Depto. de Fisiologia e Biofísica Doutorado em Fisiologia Humana Análise de Canais para Na+ Ativados por Voltagem em Neurônios do Gânglio da Raiz Dorsal João Luis Carvalho de Souza – aluno de doutorado Antônio Carlos Cassola – orientador Setembro de 2006 São Paulo – Brasil

Potencial de ação Nav Kv Kir/Twik Kir/Twik Kv voltagem (mV) -70 Nav Kv voltagem (mV) Kir/Twik Kir/Twik Kv -70 1 tempo (ms)

Superfamília de Canais Ativados por Voltagem

Nomenclatura e Genealogia dos canais para Na+ Nav 1.1 Nav 1.2 Nav 1.3 Nav 1.7 Nav 1.4 Nav 1.6 Nav 1.5 Nav 1.8 Nav 1.9 75 80 85 90 95 100 Nav 1.1 Nav 1.2 Nav 1.3 Nav 1.4 Nav 1.5 Nav 1.6 Nav 1.7 Nav 1.8 Nav 1.9 % de identidade na seqüência de aminoácidos

Estrutura terciária de canais iônicos 6 TM 2 TM Kcsa Kv Doyle et al, 1998

Filtro de seletividade em solução no filtro Doyle et al, 1998

Estrutura terciária de canais iônicos ativados por voltagem Kv1.2 MacKinnon et al, 2005

Ativação e inativação dos canais para Na+ Kcsa

Farmacologia dos Nav

Farmacologia dos Nav Bloqueio do poro

Farmacologia dos Nav Alteram a dependência de voltagem por efeito alostérico Sítios em segmentos transmembrana batrachotoxin, ciguatoxin

Sítios em alças extracelulares Farmacologia dos Nav Alteram a dependência de voltagem por estabilizar segmentos transmembrana Sítios em alças extracelulares a-scorpion toxins sea-anemone toxins spider toxins b-scorpion toxins

Farmacologia dos Nav Anestésicos locais

Expressão de canais para Na+ ativados por voltagem em células de mamíferos

Expressão de canais para Na+ em mamíferos Células não neuronais Neurônios

Canais para Na+ em gânglio da raiz dorsal (GRD) Nav 1.1 TTX-R TTX-S 75 80 85 90 95 100 Nav 1.2 Nav 1.3 Nav 1.7 Nav 1.4 Nav 1.6 Nav 1.5 Nav 1.8 Nav 1.9 % de identidade

Registro de correntes de Na+ ativadas por voltagem pela técnica de “voltage clamp” Im = Vm Gm x fixa

Fixação de voltagem “Voltage clamping” tradicional Vm i Vc célula 10mm

Fixação de voltagem “Voltage clamping” / “Patch Clamping” Vc Rf Vc Ra Rm Cm Cp Icp Ip Ic Im Rf Hamill et al, 1981

INa+ ativadas por voltagem INav = (Vm-Vr) x GNav +80 mV -20 -25 -15 -10 -5 5 10 15 20 Im (nA) -110 mV Vr 5 nA 5 ms 40 -80 -60 -40 -20 20 60 80 100 Vm (mV) Extracelular - banho NaCl 50 mM Cloreto de colina 82 CaCl2 1,8 CoCl2 1 KCl 4 Hepes 10 Glicose 5 pH 7,4 (NaOH) Sol. Intracelular - pipeta NaCl 10 mM CsF 150 TEA 10 EGTA 9 Hepes 10 ATP 2 pH 7,4 (CsOH) ENa= +41,5 mV

Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas

Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas RELAÇÃO I-V 10 Ipico (nA) 8 6 4 2 Vm (mV) -80 -60 -40 -20 20 40 60 -2 -4 -6 -8 -10

Duas equações de Ohm-Boltzmann são necessárias para se ajustar à relação IV

Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas RELAÇÃO I-V -10 -8 -6 -4 -2 2 4 6 8 10 -90 -70 -50 -30 30 50 Vm (mV) INa - pico (nA) Componente 1 Componente 2 soma 10 Ipico (nA) 8 10 20 30 40 50 60 number of cells V1/2 classes (mV) LV conductance HV conductance Gaussian fitting of data -50 -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 5 6 4 2 Vm (mV) -80 -60 -40 -20 20 40 60 -2 -4 n=200 -6 -8 -10

Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas INATIVAÇÃO ESTACIONÁRIA 1 ms 2 nA -160 mV -5 mV 0 mV -110 mV -15000 -10000 Pico de corrente (pA) dado 1 equação -5000 -180 -160 -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 Vpré-pulso (mV)

Duas equação de Boltzmann são necessárias para se ajustar à curva de inativação estacionária

Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas INATIVAÇÃO ESTACIONÁRIA total componente 1 componente 2 -15000 -10000 Pico de corrente (pA) dado 1 equação 2 equações -5000 -180 -160 -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 Vpré-pulso (mV)

Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas CINÉTICAS E ATIVAÇÃO E INATIVAÇÃO dado 1 equação 1 nA 1 ms 0 mV -110 mV 5 ms 20 nS Hodgkin and Huxley, 1952c

curva de ativação e inativação da condutância no tempo Duas equações do modelo de Hodgkin e Huxley são necessários para se ajustar à curva de ativação e inativação da condutância no tempo

Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas CINÉTICAS E ATIVAÇÃO E INATIVAÇÃO 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 -5 5 15 25 35 tempo (ms) fração de condutância componente 1 componente 2 total dado 1 equação 2 equações 5 ms 20 nS

recuperada da inativação Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas CINÉTICA DE RECUPERAÇÃO DA INATIVAÇÃO 1,0 20 ms 1 nA 0 mV -110 mV 0,8 0,6 recuperada da inativação fração de corrente 0,4 0,2 0,0 20 40 60 80 100 120 intervalo entre pulsos (ms)

Duas exponenciais são necessárias para se ajustar à cinética de recuperação da inativação das condutâncias ativadas por voltagem

recuperada da inativação Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas CINÉTICA DE RECUPERAÇÃO DA INATIVAÇÃO dado 1 equação 2 equações CONTROLE 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 20 40 60 80 100 120 tempo fração recuperada da inativação EXP1 EXP2 SOMA 1,0 0,8 0,6 recuperada da inativação fração de corrente 0,4 0,2 0,0 20 40 60 80 100 120 intervalo entre pulsos (ms)

Conclusões Neurônios do gânglio da raiz dorsal de ratos neonatos expressam populações de canais para Na+ ativados por voltagem com diferentes propriedades biofísicas. Métodos biofísicos de análise são úteis em distingüir as duas populações de canais.

Agradecimentos Prof. Dr. Antônio Carlos Cassola

FIM

f(x) x f(x) = mx + b m= 1,3 b= 2 -1,3 f(x) = 1,3x – 1,3 5 4 3 2 1 -5 -4 -3 -2 -1 f(x) = mx + b m= 1,3 b= 2 -1,3 f(x) = 1,3x – 1,3