Profª Marília Andrighetti Replicação do DNA Profª Marília Andrighetti 1 1

Replicação do DNA Todos os organismos devem duplicar o seu DNA com extrema precisão antes de cada divisão celular; Mecanismos básicos de replicação: Separação das cadeias de DNA Cópia de cada cadeia que serve como molde Síntese da nova cadeia complementar

Replicação semi-conservativa

Existem origens de replicação Se a replicação começasse por um extremo da molécula de DNA e terminasse em outro, estima-se que seria necessário 1 mês para o cromossomo humano se replicar; No genoma procarioto existem uma origem de replicação; já em células eucariontes existem múltiplas origens de replicação. Em um cromossomo médio existem, pelo menos 200 origens de replicação; Unidades de replicação (replicons): início da replicação em várias origens ao longo do genoma.

Replicação é bidirecional Uma vez iniciada a replicação em cada ponto da origem ela se propaga para os dois lados da molécula de DNA até encontrar replicons vizinhos Replicação bidirecional envolve duas forquilhas de replicação que se locomovem em direções opostas.

Replicação é semidescontínua A polimerização dos desoxirribonucleotídeos na síntese do DNA acontece somente na direção 5’ 3’; Porém, as duas fitas são antiparalelas.... logo, como ambas as fitas podem ser sintetizadas simultaneamente??? A cópia da cadeia parental 3’ 5’ pode ser sintetizada continuamente. Essa cadeia filha que avança na direção 5’ 3’ recebe o nome de cadeia líder ou cadeia contínua; A cadeia parental 5’ 3’ deve ser copiada de forma descontínua, a qual recebe o nome de cadeia retardatária, ou cadeia descontínua.

Replicação é semidescontínua Os fragmentos da cadeia descontínua recebem o nome de fragmentos de Okazaki; São cadeias curtas: Procariontes: 1000-2000pb; Eucariontes: 200-300pb.

Origens de replicação Locais com sequência específica fácil de separar Ligam proteínas iniciadoras Quando acionadas, essas proteínas permitem o início da replicação

Origens de replicação Tendem a ser ativadas em grupo, formando unidades de replicação. 11 11

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Replicação DNA Polimerase Sentido 5’ → 3’ Nucleotídeos 3P são adicionados Liberação de Pirofosfato 13 13

Micrografia, bolha de replicação Forquilhas de replicação 14 14

Forquilha de Replicação

Primase Sintetiza um primer de RNA contendo aproximadamente 11 bases; fornece 3’ OH DNA-polimerase adiciona os nucleotídeos iniciais na origem de replicação dos pequenos fragmentos de Okazaki;

Replicação das fitas Fita líder Fita retardada Primase age uma vez Primase age várias vezes Fragmentos de Okasaki

Direções de replicação na Forquilha

Desenovelamento do DNA Proteínas de ligação a fita simples (SSPs) DNA helicase Quebra pontes de H DNA topoisomerases - Relaxam o estresse contorcional imposto pelo desenrolamento;

Forquilha de replicação Polaridade da síntese define fitas líder e retardada (descontínua) 20 20

DNA polimerase Enzimas que catalisam a reação de síntese do DNA. Adiciona nucleotídeos tri- fosfato à extremidades 3’OH livre. Alongamento da cadeia de DNA sempre é feito na direção 5’-3’. Incapaz de fazer DNA do zero (precisa ter extremidade 3’OH livre). Possui mecanismo de correção de erros (exonuclease 3’-5’)

DNA-polimerases - Procariotos Tipo Função DNA Polimerase I Catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5’ 3’; Atividade de exonuclease 3’5’ Remove o primer de RNA da fita descontínua. DNA Polimerase II Polimerase alternativa de reparo. DNA Polimerase III Catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5’ 3’. É a polimerase primária durante a replicação normal do DNA

DNA-polimerases - Eucariotos Tipo Função DNA Polimerase α (alfa) Replicação do cromossomo nuclear (fita descontínua) DNA Polimerase δ (delta) Replicação do filamento contínuo do cromossomo nuclear DNA Polimerase ε (épsilon) Reparo do DNA do cromossomo nuclear DNA Polimerase β (beta) É pequena e atua no reparo de DNA DNA Polimerase γ (gama) Replicação de DNA mitocondrial

DNA Replication DNA Pol precisa de um molde inicial Primase: gera um molde de RNA complementar A DNA Pol III agora é capaz de adicionar bases à extremidade 3’OH 25 25

Eliminação dos fragmentos de Okasaki DNA Pol I 26 26

Mecanismo da enzima Ligase 27 27

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Repare na posição do primer de RNA Visão geral Repare na posição do primer de RNA 29 29

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Reparo pela Polimerase Mecanismo de verificação (Proof-reading) DNA-polimerase possui Uma atividade de polimerização 5’→ 3’ Uma atividade de exonuclease 3’→ 5’ 31 31

Reparo pela Polimerase Mecanismo de verificação (Proof-reading) DNA-polimerase possui Uma atividade de polimerização 5’→ 3’ Uma atividade de exonuclease 3’→ 5’

DNA Repair Checagem de pareamento incorreto (eucariotos) Proteínas especiais para reparo do erro 33 33

E as extremidades dos cromossomos? 34 34

Ciclo celular A replicação do DNA é regulada temporalmente Fase S do ciclo celular Ciclinas

Conclusões Replicação semi-conservativa Bolha de replicação avança em duas direções Fita líder e fita retardada Helicases e topoisomerases desenrolam o DNA Primase faz o primer DNA polimerase III, DNA polimerase I DNA ligase Telomerase