CAP3 (Contig Assembly Program) George Darmiton da Cunha Cavalcanti (gdcc@cin.ufpe.br) UFPE – CIn Junho de 2001

Roteiro Introdução Arquitetura O Programa CAP3 – Entrada e Saída Pontos Fortes e Fracos do CAP3 Resultados do CAP3 CAP3 versus PHRAP Bibliografia

Introdução É um programa utilizado para montar cadeias de DNA Desenvolvido por Xiaoqiu Huang, Department of Computer Science, Michigan Technological University Versão 3 foi desenvolvida em 1999 Atualmente encontra-se na versão 4, sendo esta comercial

Arquitetura 1º Fase 2º Fase 3º Fase Remoção de regiões pobres Calcular sobreposição Remoção de falsas sobreposições Construção de Contigs Construção do Consenso 2º Fase 3º Fase

Primeira Fase Composta de três etapas Remoção de regiões pobres Cálculo da sobreposição Remoção de falsas sobreposições Antes dessas etapas é necessário identificar sobreposições entre fragmentos.

Primeira Fase Identificação de sobreposição Criar a seqüência combinada Os fragmentos f1, f2, ..., fn são concatenados Caracter especial separa dois fragmentos f1 # f2 # ... # fn Para cada fragmentos fx e o seu complemento reverso rx, encontrar o par (fx, fy) e (rx, fy) tal que x<y e que os fragmentos tenham uma sobreposição relevante Para cada par com sobreposição uma faixa diagonal da matriz da programação dinâmica e calculado. (Smith e Waterman 1981) Essa matriz será usada mais adiante por motivo de eficiência

Primeira Fase Remoção de Regiões Pobres Calcular sobreposição Remoção de falsas sobreposições Construção de Contigs Construção do Consenso 2º Fase 3º Fase

Primeira Fase Remoção de Regiões Pobres (cont.) Posição de remoção 5’ Fragmento h Fragmento f Fragmento g Posição de remoção 3’

Primeira Fase Remoção de Regiões Pobres (cont.) O algoritmo de alinhamento local de Smith e Waterman foi generalizado para usar valores de qualidade de base Sendo p a probabilidade do erro estimado para a base m * min(q1, q2) n * min(q1, q2) -g * min(q1, q2)

Primeira Fase Remoção de Regiões Pobres (cont.) Os valores que indicam a qualidade da base são usados para permitir que: Matches em bases que possuem altos valores de qualidade recebem alta pontuação positiva; Mismatches em bases que possuem altos valores de qualidade recebem alta pontuação negativa; Matches e mismatches em bases que possuem baixos valores de qualidade recebem pontuações baixas positivas e negativas, respectivamente

Primeira Fase Remoção de Regiões Pobres (cont.) Se os valores de qualidade de base foram informados Maioria dos valores de qualidade são maiores que qualcut (-c) qualpos5 qualpos3 Fragmento f crange (-y) crange Caso os valores de qualidade da base não sejam informados qualpos5 = 1 e qualpos3 = tamanho de f A cobertura mínima é determinada por gdepth (-z)

Primeira Fase Cálculo das Sobreposições Remoção de regiões pobres Calcular sobreposição Remoção de falsas sobreposições Construção de Contigs Construção do Consenso 2º Fase 3º Fase

Primeira Fase Cálculo das Sobreposições (cont.) O alinhamento global é utilizado para calcular a sobreposição entre fragmentos Alinhamento global versus Alinhamento local Utilizando o método global é possível identificar falsas sobreposições. mostrar que algumas regiões dos fragmentos não são similares, indicando que esta sobreposição é falsa. O alinhamento local está restrito a regiões similares.

Primeira Fase Remoção de Sobreposições Falsas Remoção de regiões pobres Calcular sobreposição Remoção de falsas sobreposições Construção de Contigs Construção do Consenso 2º Fase 3º Fase

Primeira Fase – Remoção de Sobreposições Falsas (cont.) Cada sobreposição é avaliada por 5 (cinco) medidas 1ª Medida Informa o comprimento mínimo para a sobreposição (-o) 2ª Medida Determina que o percentual de identidade não deve ser menor que o valor estabelecido pela opção –p 3ª Medida Determina o valor de similaridade da sobreposição (-s) m * min(q1, q2) n * min(q1, q2) -g * min(q1, q2)

Primeira Fase – Remoção de Sobreposições Falsas (cont.) 4ª Medida Se a sobreposição contiver um número grande de diferenças entre bases de altos valores de qualidade, essa sobreposição é provavelmente falsa. (-b e -d) 5ª Medida Se o número de diferenças em uma sobreposição for maior que o esperado, então é provável que essa sobreposição seja falsa. (-e) Caso uma dessas medidas falhe, a sobreposição é considerada falsa.

Segunda Fase Construção dos Contigs Remoção de regiões pobres Calcular sobreposição Remoção de falsas sobreposições Construção de Contigs Construção do Consenso 2º Fase 3º Fase

Segunda Fase Construção dos Contigs (cont.) 1ª Etapa Um layout inicial é gerado Método guloso 2ª Etapa A qualidade do layout corrente é avaliada O número de restrições satisfeitas e não satisfeitas é calculado para cada sobreposição Restrições não satisfeitas são particionadas em grupos cada grupo possui restrições associadas com uma sobreposição não usada ou com um par de contigs

Segunda Fase Construção dos Contigs (cont.) 3ª Etapa O grupo com o maior número de restrições não satisfeitas é selecionado Caso 1 grupo associado a uma sobreposição não usada Caso 2 grupo associado a um par de contigs Se nenhuma correção for feita o processo é repetido com os grupos restantes Caso contrário a 2ª etapa é repetida para o novo layout

Terceira Fase Construção do Consenso Remoção de regiões pobres Calcular sobreposição 1º Fase Remoção de falsas sobreposições Construção de Contigs 2º Fase Construção do Consenso 3º Fase

Terceira Fase Construção do Consenso (cont.) A soma ponderada dos valores de qualidade é calculada para cada base Os valores de qualidade são divididos em dois grupos, um para cada sentido (5’ 3’ - 3’ 5’) cada grupo é ordenado em ordem decrescente pesos: w1=1, wi = 0.5, para i>1 Ex: 20+, 40-, 30+ e 10- grupo1: 30+ e 20+ grupo2: 40- e 10- soma ponderada = 30(1) + 40(1) + 20(0.5) + 10(0.5) = 85

Terceira Fase Construção do Consenso (cont.) Cálculo da média do valor de qualidade

Terceira Fase Construção do Consenso (cont.)

Parâmetros de Entrada do CAP3 CAP3 recebe um arquivo com as seqüências de fragmentos no formato FASTA Uso: cap3 arquivo_de_fragmentos [opções] Arquivos opcionais arquivo contendo os quality values no formato FASTA, usando extensão .qual arquivo contendo restrições forward-reverse, usando extensão .con. Pode ser gerado usando o programa FORMCON Formato: ReadA ReadB MinDistance MaxDistance Cada linha do arquivo de restrições especifica uma forward-reverse constraint da seguinte forma: ReadA ReadB MinDistance MaxDistance Sendo ReadA e ReadB o nome dos fragmentos, e MinDistance e MaxDistance são distâncias em número de pares de base. A restrição é satisfeita se ReadA, que está na orientação forward, ocorre em um contig antes de ReadB que está na orientação reversa, ou ReadB em orientação forward ocorre em um contig antes que ReadA em orientação reversa, e suas distâncias estão entre MinDistance e MasDistance. CAP3 funciona melhor se muitas restrições são usadas.

Opções Valor das penalidades Faixa Diagonal Parâmetro descrição -g N gap N>0 (6) -m N match N>0 (2) -n N mismatch N<0 (-5) Faixa Diagonal N>10 (20) -a N descrição Parâmetro

Resposta do Programa Consenso no formato ace Consenso arquivo com extensão .ace Consenso arquivo com extensão .contigs Quality values do consenso arquivo com extensão .contigs.qual Fragmentos não são usados na montagem arquivo com extensão .singlets

Resposta do Programa (cont.) Informações adicionais sobre a montagem arquivo com extensão .info Satisfação das restrições arquivo com extensão .results

Pontos Fortes do CAP3 Uso de forward-reverse constraints para corrigir erros de montagem Objetivo: localizar e corrigir erros no layout da seqüência e ligar contigs separados por gaps Dois fragmentos devem estar em direções opostas na molécula de DNA e a uma determinada distância. O algoritmo usado no CAP3 é tolerante a restrições erradas Forward-reverse constraint estabelece que dois fragmentos devem estar em direções opostas na molécula de DNA, separados por um determinada distância. Essas restrições são utilizadas no CAP3 para localizar e corrigir erros na montagem. Essa capacidade permite CAP3 encontrar erros provenientes de repetições. CAP3 usa base quality values na geração do alinhamento das seqüências e na geração do consenso a partir dos contigs. Isto permite que o programa use quality values e cobertura para melhorar a precisão na geração do consenso. Remoção de regiões pobres são usadas para garantir que apenas as regiões boas dos fragmentos serão montadas.

Pontos Fortes do CAP3 (cont.) Geração do resultado da montagem no formato ace para Consed Consed – ferramenta gráfica para editar seqüências CAP3 pode ser usado no GAP4 do pacote Staden. GAP4(Genome Assembly Program) é uma ferramenta gráfica do pacote de ferramentas Staden

Pontos Fortes do CAP3 (cont.) Uso de base quality values Usados no alinhamento de fragmentos e na construção do consenso. Melhora a qualidade na geração do consenso Remoção de regiões pobres, 5’ e 3’ Objetivo Utilizar apenas regiões ‘boas’ do fragmento na montagem.

Pontos Fracos do CAP3 A remoção de regiões ditas pobres, pode excluir áreas importantes no processo de alinhamento Tempo de processamento A ferramenta não possui interface gráfica (entretanto pode ser usada no pacote GAP4)

Resultados do CAP3 Conjunto de dados BAC (Bacterial Artificial Chromossome) GenBank Nº Nº de frag Tam médio frag Tam seq 203 AC004669 1812 598 89.779 216 AC004638 2353 614 124.645 322F16 AF111103 4297 1011 159.179 526N18 AF123462 3221 965 180.182 Dados Tempo (min) Nº de contigs Tam seq CAP Nº de <> 203 37 1 90.292 216 154 132.057 17 322F16 127 157.982 11 526N18 73 2 180.128 10

CAP3 versus PHRAP Conjunto de dados BAC PHRAP, normalmente, produz cadeias mais longas de contigs CAP3 produz menos erros no consenso Caso os valores de qualidade da base não estejam disponíveis CAP3 é uma boa escolha já que trata redundância

Bibliografia Xiaoqiu Huang, Anup Madan. CAP3: A DNA Sequence Assembly Program. Genome Research 9:869-877, 1999. Xiaoqiu Huang. Na Improved Sequence Assembly Program. Genomics 33, 21-31, 1996. Site oficial na Internet. http://genome.cs.mtu.edu/cap3/cap3.html Staden Package WWW site. http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/pubseq/staden_home.html http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/pubseq/contig.html