Melhoramento de Plantas e Indução de mutações

MUTAÇÕES INDUZIDAS Definição: mutação provocada por incorporação de análogos de bases (Ex: 5-bromouracil ou 2-aminopurina), agentes físicos (Ex: luz U.V. e outros tipos de radiações) ou químicos (EMS, EES, Azida sódica...) em laboratório ou no ambiente, elevando as taxas de mutação em relação àquela esperada espontaneamente. Princípios As mutações ocorrem ao acaso; A mutação é um evento unicelular; A maioria das mutações são deletérias;

Usos de mutações no melhoramento de plantas 1. Usos de mutações pontuais Espécies autógamas - Mutação direta em variedades melhoradas; - Cruzamentos: - mutantes com variedade original; - entre mutantes diferentes, de mesma variedade; - entre mutantes diferentes, originados de variedades diferentes; - mutantes com variedade diferente da original; - entre duas variedades carregando aparentemente a mesma mutação;

1. Usos de mutações pontuais (continuação) b) Espécies alógamas - Indução de mutações para aumento de variabilidade; - Indução de mutações em linhagens endogâmicas; c) Indução de macho-esterilidade (autógamas e alógamas) d) Plantas de propagação assexuada - Indução de mutantes para uso direto (clonagem);

2. Usos de mutações cromossômicas e genômicas Uso de translocações visando a transferência de características entre espécies ou gêneros; Quebra de ligações genéticas; Diploidização em híbridos inférteis; Poliploidização;

3. Usos para resolver problemas especiais Uso para a produção de plantas haplóides; Uso para a produção de sexualidade transitória em plantas apomíticas; Uso para reduzir a incompatibilidade em cruzamentos distantes; Uso para estudos especiais de genética, fisiologia, morfologia, biologia molecular (genômica funcional) e processos bioquímicos, em plantas;

Usos práticos (resumo) MUTAGÊNESE INDUZIDA Usos práticos (resumo) Correção de defeitos (em variedades elite); Limitações de variabilidade genética; Indução de mutações em plantas estéreis; Indução de mutações em plantas com dificuldades ou desvantagens na realização de cruzamentos;

MUTAGÊNICOS

MUTAGÊNICOS FÍSICOS Radiações ionizantes e não-ionizantes 1. Ionizantes: a energia da radiação produz ionizações Radiações Eletromagnéticas Raios-gama, X, nêutrons Partículas: Alfa, beta, prótons e dêuterons 2. Não-ionizantes: a energia da radiação produz excitação a) Luz U.V. (é uma radiação eletromagnética, mas não ionizante)

1 eV = 1,602 x 10-12 erg Tipos de radiação Fonte Descrição Energia Perigos Proteção necessária Penetração em tecidos Raios-X Aparelho raios-X Radiação Eletromagnética 50 a 300 kV Perigosa penetrante Poucos mm de chumbo Poucos mm até vários cm Raios-gama Radioisótopos ou Reatores nucleares Acima vários MeV Perigosa muito penetrante Muitos cm de chumbo ou concreto de Alta densid. vários cm Nêutrons (rápidos, lentos e térmicos) Reatores nucleares ou aceleradores Párticula não-carregada (ligeiram. + pesada que o próton) menos 1 eV até vários MeV Muito perigosa Proteção fina de concreto Partículas Beta Radioisótopos ou aceleradores Elétron (+ ou -) ionizado, muito menos denso que partic. Alfa Acima vários eV Pode ser perigosa proteção grossa de papel Até vários mm 1 eV = 1,602 x 10-12 erg

contêm 1 próton e 1 nêutron Tipos de radiação Fonte Descrição Energia Perigos Proteção necessária Penetração em tecidos Partículas Alfa Radioisótopos Núcleo do He ionizado muito pesadamente 2 a 9 MeV Muito perigosa internamente proteção fina de papel Poucos mm Prótons e Dêuterons Reatores nucleares ou aceleradores Núcleo do H Acima de vários GeV Muito perigosa Muitos cm de água ou parafina até vários cm Luz Ultra violeta Lâmpadas UV. Radiação eletromagnética Poucos eV Menos perigosa pouco penetrante proteção grossa de papel Fração de mm Dêuteron = Núcleo do deutério (2H - Hidrogênio pesado, isótopo estável do H), contêm 1 próton e 1 nêutron

RADIAÇÃO- X Comprimento de onda de 0,001 a 10 nm, de acordo com a voltagem de pico (kVp) Obtenção: elétrons são acelerados no vácuo e parados por alvo de Tungstênio ou Molibdênio: A desaceleração é acompanhada de emissão de radiação. Tipos: Hard: Maior pico de voltagem do equipamento, menor comprimento de onda, maior penetração, menor poder ionizante = parecido com os raios-gama usado para radioterapia Soft: maior comprimento de onda; usado para exames

RADIAÇÃO- X Vantagens: Mais facilmente disponíveis; Fácil manipulação, mais baratos; Menores cuidados de vigilância e contaminação; Desvantagens: Menor homogeneidade (maior variação na energia); Dificuldade de uso para tratamentos prolongados; Limitação do tamanho do material a ser tratado;

RADIAÇÃO- GAMA Raios-gama apresentam menor comprimento de onda e maior energia por fóton (em comparação com os raios-X); Raios gama monoenergéticos são obtidos por radioisótopos 60Co - meia vida de 5,3 anos (metal) 137Cs - meia vida de 30 anos ( cloreto ou sulfato) Vantagens: - Tratamentos prolongados; Diferentes tipos e partes de plantas; Usos em casa de irradiação, casa de vegetação e campo;

NÊUTRONS Obtenção: reatores nucleares (pela fissão nuclear do Urânio 235) ou em aceleradores de partículas; Classificação de acordo com a energia: Nêutrons rápidos: (maior energia); - Nêutrons térmicos: (energia é reduzida por moderadores de C ou H);

LUZ ULTRA VIOLETA - Obtenção: lâmpadas de U.V. - O efeito biológico varia com o comprimento de onda. - Usar luz com comprimento de onda na faixa de 2.500 e 2.900 nm: região de máxima absorção de luz pelos ácidos nucléicos; Uso limitado: baixa penetrabilidade em tecidos – associação com cultura de tecidos; maior uso para bactérias e microorganismos; uso em grãos de pólen;

UNIDADES DE RADIAÇÃO Dose absorvida : Rad e Gray (Gy) Rad: quantidade de energia absorvida por massa de matéria irradiada 100 rad; 500 rad, 1 Krad etc... 1Gy = 100 rad logo 1 Krad = 10 Gy

UNIDADES DE RADIAÇÃO Dose emitida: Roentgen (R) R: medida indireta: número de íons produzidos no ar por uma radiação ionizante; 100 R; 500 R, 1 KR, etc... Para finalidades práticas: 1 R = 1 Rad

EQUIPAMENTOS Fontes de raios-gama - Fonte Gamma Cell; Fonte de sala; Fonte de casa de vegetação; Fonte Gamma field; Fonte de piscina (Urânio 235);

Aparelho de raios-X

Fonte de raios-gama (Gamma Cell)

Fonte de raios-gama (câmara de irradiação)

Fonte de raios-gama (Gamma Field)

Fonte de piscina

MUTAGÊNICOS QUÍMICOS Grupos principais (Manual on Mut. Breed., 1977) Bases análogas [Exs: 5- Bromo-uracil (BU), 5-bromo-deoxiuridina (BUdR), 8-ethoxi-cafeína (EOC), Hidrazida maleica (MH),...] Antibióticos (Exs: azaserina, mitomicina C, estreptonigrina, actinomicina D) Agentes alquilantes (Exs: gás mostarda, EMS, MMS, MNU, ...) Azida sódica (NaN3)

MUTAGÊNICOS QUÍMICOS Grupos principais (Manual on Mut. Breed., 1977) Hidroxilamina (NH2OH) Ácido nitroso (HNO2) Acridinas (C13H9N) – agente intercalante de DNA e RNA

Mutagênico Natureza Densidade (g/ml) Solubilidade em água Peso molecular (g/mol) EMS Liq. Incolor 1,203 8% 124 EI 0,832 qq. proporção 43 DES 1,177 154 Azida Sólido branco 1,846 65 Propriedades físicas e químicas de alguns mutagênicos químicos (IAEA, 1977)

Cálculo Tratamento 500 ml de solução 0,03 M de EMS Qual o volume de EMS ???

Cálculo Tratamento 500 ml de solução 0,03 M de EMS Qual o volume de EMS ??? PM = 124 g/mol 0,03 M = 3,72 g em 1 L d = 1,203 g/ml = 1,86 g em 500 ml 1,203 g - 1 ml 1,86 g - x ml x = 1,546 ml

Temperatura (oC) DES (h) EMS (h) 40 0,32 7,92 30 1,00 25,9 20 3,34 93,1 10 13,1 378 27,6 796 Meia-vida* (em horas) de DES e EMS em várias temperaturas (IAEA, 1977) * Meia-vida: Tempo na qual metade da concentração do mutagênico reagiu com a água para formar ácido e álcool.

Mutagênico Químico

Mutagênico Químico

EFEITOS DOS MUTAGÊNICOS

EFEITOS FISIOLÓGICOS (M1; V1M1) EFEITOS GENÉTICOS (M2; M3… V2M1; V3M1…) Redução: Taxa de germinação Sobrevivência Altura de planta Número de brotos Mutações gênicas Mutações cromossômicas Aumento: Esterilidade Importância Seleção de doses: LD 30 – 50 GR 30 – 50

Já está mais que comprovada a existência de alta correlação entre efeitos fisiológicos (geração M1 ou M1V1) e frequência de mutações nas gerações sucessivas M2, M3 e etc... ( ou M1V2, M1 V3...). Sendo assim, os testes de sensibilidade aos mutagênicos auxiliam reduzindo o tempo para a execução dos experimentos de indução de mutações em plantas.

MATERIAIS E MÉTODOS DE TRATAMENTO Todas as partes das plantas podem ser tratadas com mutagênicos; Propágulos apresentam diferenças na sensibilidade; Exemplos: Sementes de feijão - aproximadam. - 250 Gy Grão de pólen - aproximadam. - 1.000 Gy Explantes in vitro - aproximadam. - 10 Gy

QUAIS PARTES DA PLANTA DEVEM SER TRATADOS COM MUTAGÊNICO ?? Resp. Depende dos objetivos do trabalho e do método de propagação da planta a) Irradiação de plantas inteiras Plantas grandes – Campos de irradiação Gamma field Plantas pequenas – Câmara de irradiação b) Sementes - material favorito Vantagens: manuseio mais simples; grande número de indivíduos em pouco espaço; possível modificar as condições ambientais; fácil de ser enviado a longas distâncias; luz UV. pouco efeito, devido a baixa penetrabilidade;

c) Grãos de Pólen (óvulos também) Vantagens: evitam quimerismo; menor volume; possível usar luz UV. (pólen); Desvantagens: dificuldades de obtenção; viabilidade decai rapidamente; d) Propágulos de PPV. Estolões, gemas axilares, bulbos, cormos, borbulhas, folhas... e) Explantes (Cultura de células e de tecidos) Meristemas, calos, células em suspensão, folhas, protoplastos... Vantagem: Possível usar luz UV. e mutagênicos químicos

Uso de grãos de pólen na mutagênese induzida Gametas não irradiados Mutagênico A a A A A A Mutação recessiva A A A A A a A A Gametas não irradiados (somente A) Gametas irradiados (A ou a) X Geração M 1 Genótipo AA (sem mutação) Genótipos AA ou Aa (sem quimerismo) Geração M 2 Genótipo AA (sem mutação) Genótipos AA, Aa ou aa

Uso de grãos de pólen na mutagênese induzida Gametas não irradiados Mutagênico a a a Mutação dominante a a A a a a a a a a a Gametas não irradiados (somente a) Gametas irradiados (A ou a) X Geração M 1 Genótipo aa (sem mutação) Genótipos Aa ou aa (sem quimerismo) Geração M 2 Genótipo aa (sem mutação) Genótipos AA, Aa ou aa

mutagênese induzida em organismos diplóides AA AA AA Geração M 0 AA AA AA Mutagênico Aa AA AA Geração M 1 AA (quimerismo) Aa AA Produção de Gametas A e a A partir da Geração M 2 (segregação) AA Aa aa

mutagênese induzida em organismos diplóides aa aa aa Geração M 0 aa aa aa Mutagênico aa aa aa Geração M 1 aa (quimerismo) Aa aa Produção de Gametas A e a A partir da Geração M 2 (segregação) AA Aa aa

Cálculo da frequência de mutantes Vários métodos : usa-se mais frequentemente a % de mutantes em 100 (ou 1.000) plantas da geração M2 Mutantes em geral ou mutantes de clorofila Cálculo da frequência de mutações - usa-se mais frequentemente a % de mutações de uma dada característica em 100 (ou 1.000) plantas da geração M2

MUTANT DATABASE - IAEA http://mvgs.iaea.org/AboutMutantVarieties.aspx

http://mvgs.iaea.org/AboutMutantVarieties.aspx