Laboratório de Vírus Departamento de Microbiologia Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal de Minas Gerais Linha de Pesquisa PROGRAMA MITOGÊNICO DESENCADEADO DURANTE A INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS VACCÍCIA Grupo de Transdução de Sinal Orientador: Cláudio Antônio Bonjardim

INTRODUÇÃO

Parasitas intracelulares obrigatórios Vírus Agentes infecciosos Constituídos basicamente de uma cápsula protéica que guarda o material genético – RNA ou DNA. Parasitas intracelulares obrigatórios Extremamente dependentes de toda maquinaria energética e biossintética de seus hospedeiros

Interação Vírus-hospedeiro Hospedeiro susceptível Interações altamente especializadas Tropismo da infecção

Interação Vírus-hospedeiro Manipulação das respostas e funções celulares do hospedeiro: Evasão da resposta imune Interferência na produção de citocinas Controle da repressão/indução da apoptose Controle da proliferação e/ou diferenciação celular Manipular e intervir nas vias de sinalização que regulam esses processos Criação um ambiente celular propício para uma multiplicação bem-sucedida

Citoplasma Alterações nas vias de sinalização celular e transcrição gênica do hospedeiro Núcleo

MAPK

(Mitogen-activated protein kinase) MAPKs (Mitogen-activated protein kinase) Proliferação Diferenciação Apoptose Sobrevivência

Cascata de Sinalização das MAPKs Fatores de Crescimento, Mitógenos, GPCRs Estresse, Fatores de Crescimento, GPCRs, Citocinas Inflamatórias Estímulo MEKKs Raf MAPKKK MKK7 MKK4 MKK3 MKK6 MEK MAPKK JNK/ SAPK p38 ERK MAPK Crescimento, Diferenciação, Desenvolvimento Resposta Biológica Inflamação, Apoptose, Crescimento, Diferenciação

Os Vírus e as MAPKs Vírus Vaccinia Hepatite B (HBx) Hepatite C Influenza Vírus Vaccinia Herpes HIV

Vírus Vaccínia Pertencente à mesma família do vírus causador da varíola Utilizado para imunização contra a varíola (1967 – 1977) Erradicação da doença no mundo Atualmente – vírus de laboratório Década de 80 – grande interesse pelo VV como ferramenta de estudos em biologia molecular Recentemente, verificou-se a emergência de zoonoses causadas pelo vírus vaccínia-like.

Vírus Vaccínia Características: Complexos vírus envelopados que medem em torno de 300 nm; Genoma – DNA fita dupla linear; Ciclo replicativo citoplasmático. 2 tipos de partículas infectivas: - IMV: 90% da progênie viral - EEV: principais formas de disseminação do VV Família: Poxviridae Subfamília: Chordopoxvirinae Gênero: Orthopoxvirus

Genoma do Vírus Vaccínia 191 Kpb / 263 genes ITRs Genes Conservados Genes essenciais – polipeptídeos estruturais e enzimas envolvidas no metabolismo da DNA Variáveis - Genes não-essenciais – interação com o hospedeiro e virulência

Ciclo de Multiplicação Núcleo Desnudamento secundário Desnudamento primário Replicação do DNA Vírion IMV Transcrição de genes imediatamente precoces Transcrição de genes imediatamente precoces Transcrição de genes precoces Transcrição de genes tardios EEV IEV Morfogênese IMV

Poxvírus e Mitogênese Fator de Crescimento do VV - VGF Similaridades estruturais e funcionais ao EGF e TGF- ; Liberado no sobrenadante das células infectadas; Estimula o crescimento e/ou a atividade metabólica de células não infectadas adjacentes, favorecendo a expansão da infecção; A atividade mitogênica de VGF é considerada benéfica para a replicação do VV.

MEK MEK ERK 1/2 ERK 1/2 RSK 2 c - fos Elk-1 EGR-1 Andrade et al, 2004 Magalhães et al, 2001 Citoplasma EGR-1 Núcleo

TyK ? MEK JNK ERK RSK-2 Elk-1 STK ? ? c-jun EGR-1 CREB/ATF-1 Andrade et al, 2004 TyK MEK ERK RSK-2 Elk-1 ? c-jun JNK STK ? CREB/ATF-1 ? Citoplasma EGR-1 Núcleo

Patrícia Nogueira da Gama Silva TESE DE DOUTORADO Significado Funcional do Gene de Resposta Precoce ao Crescimento – EGR-1 – para a Biologia do Orthopoxvirus Vaccinia Patrícia Nogueira da Gama Silva

? ? Ras EGR-1 Rac Rho Rac Raf MKK4/7 MEK JNK ERK Cdc42 PAK-1 PAK-1 Citoplasma EGR-1 Núcleo

Luciana Garcia Andrade Projeto de Pesquisa ENVOLVIMENTO DA PROTEÍNA QUINASE - PAK1 - DURANTE A INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS VACCÍNIA Luciana Garcia Andrade

(p21-activated kinase - 1) PAK-1 (p21-activated kinase - 1) GDP GTP Rac / Cdc42 PAK-1 Serina-treonina kinase Pro-inflamatórios/Estresse (JNK/SAPK) Dinâmica do Citoesqueleto / Motilidade Celular Proliferação/Sobrevivência (MEK/ERK)

(p21-activated kinase - 1) PAK-1 (p21-activated kinase - 1) Domínio Catalítico (aa 255 – 529) PDB AI Nck Grb2 Rac Cdc42 G Domínio Autoinibitório

OBJETIVOS

Geral Analisar a contribuição da serina/treonina quinase PAK1 (p21- activated kinase) na transmissão dos sinais mitogênicos desencadeados após a infecção de células de fibroblasto murino A31 pelo vírus vaccínia.

Específicos Gerar clones expressando de maneira estável mutação que confere dominância negativa para a proteína PAK-1; Verificar se a infecção pelo VV induz a fosforilação de PAK-1, bem como sua cinética de ativação; Verificar o significado funcional de PAK-1 na multiplicação do vírus vaccínia.

Materiais e Métodos

Células: Vírus: Células A31 – clone de Balb/3T3 - Obtenção dos clones de PAK-1 - Infecção / Expressão protéica Células VERO - Produção do estoque do VV - Titulação viral Vírus: Vírus Vaccínia WR (Western Reserve) - Purificados /Titulados

Vetores: PAK – K299R Dominante Negativo para PAK-1 pcMV6m – DN PAK1 Bam HI Eco RI Amp pcMV6m – WT PAK1 PAK1-WT Bam HI Eco RI Amp PAK – K299R Dominante Negativo para PAK-1

Sub-clonagem: PAK1 – WT PAK1 – DN       pcMV6m – WT -PAK1 Bam HI Eco RI Amp PAK1 – WT K PAK1 – DN R     pcMV6m – PAK1 – K299R PAK1- K299 R Bam HI Eco RI Amp  

Transformação bacteriana: E. coli – DH5 Transformação LB Agar + AMP

Purificação do Plasmídio LB Agar + AMP LB + AMP Amplificação de cópias do plasmídio Eletroforese em gel de agarose Pequena-escala Purificação Transfecção de células A31 Média-escala

Transfecção: Seleção dos clones resistentes pcDNA 3– PAK-WT ou pcDNA 3– PAK –K299R Células A31 Transfecção G418 Seleção dos clones resistentes Caracterização dos clones resistentes

Estratégia de Trabalho Células A31 ou Clones Carenciadas com 1% de SFB por 12 horas Infectadas com o VV (MOI de 10,0) por tempos variáveis Extração de proteínas totais “Western blot” Vírus Titulação Análise de Multiplicação Viral Fenótipo de Placa de Lise Viral Extração de mRNA total “Northern blot”

Transferência de “Western” + - + - Reação com o anticorpo primário Bloqueio Reação com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase Sistema Revelador Filme Raio-X Revelação Exposição

Transferência de “Northern” Pré hibridação Hibridação com sonda marcada Lavagem + - Exposição Revelação

Teste – caracterização dos clones de PAK-1 P-JNK 1 3 4 5 6 7 8 9 10 2 KDa 46 54 M VV M VV M VV M VV M VV A31 NT WT 6 WT 7 WT 8 WT 9 KDa 46 54 1 3 4 5 6 2 7 8 9 10 P-JNK Mock VV Mock VV Mock VV Mock VV Mock VV A31 NT DN 1 DN 5 DN 6 DN 10

Acumulação de EGR-1 induzida pelo VV

Co-participação de diversas vias sinalizadoras associadas com a indução de EGR-1 após infecção pelo VV

MEK – ERK – EGR-1

MEK/ERK 1/2 é necessária à multiplicação do VV (Fenótipo da Placa de Lise Viral) MEK-DN 3 MEK-WT10 VV 48 hpi Controle

MEK/ERK 1/2 é necessária à multiplicação do VV (Análise da Multiplicação Viral)

O Vírus Vaccínia induz a ativação de proteínas quinases e genes envolvidos com mitogênese e/ou reprogramação celular, criando as condições necessárias à geração eficiente de novas progênies virais.