Microscopia de campo escuro

Campo escuro + filtro vermelho Campo claro Campo escuro

Microscopia de campo escuro Campo escuro: bloqueio dos raios centrais, permitindo apenas iluminação oblíqua na amostra. Luz captada pela objetiva = refração + reflexão fluorescência refração absorção LUZ reflexão

Microscopia de campo escuro Tipo de contraste no campo escuro (iluminação oblíqua) 1) Negativo: amostra é mais clara do que o plano de fundo, que fica escuro. Contraste = (If - Ia) x 100 If

Microscopia de campo escuro Contraste com campo escuro ocular Plano da imagem - Os raios não desviados são obliterados; - Apenas raios desviados são captados pela objetiva. Lente do tubo objetiva Distância focal Raios não desviados amostra Raios desviados condensador

Microscopia de campo escuro O que a técnica de campo escuro faz? 1) Contraste negativo - Bloqueia os raios não desviados centrais, permitindo apenas a passagem de raios desviados num ângulo suficiente para serem captados pela objetiva; - os eventos de refração e reflexão são responsáveis pela produção de raios desviados; - a amostra fica clara sobre um fundo escuro; - cria uma aparência tridimensional da amostra; - a resolução é a mesma do campo claro.

Microscopia de campo escuro Configuração Trabalha-se nos planos da imagem conoscópica objetiva Luz não coletada pela objetiva Luz difratada pela amostra amostra condensador Anel de campo escuro Só entra luz na objetiva se houver material com índice de refração maior que o da água.

Microscopia de campo escuro Com amostra Sem amostra

Microscopia de campo escuro Dados técnicos Acessórios obrigatórios: anel de campo escuro para o condensador; Não há objetivas especiais para esta técnica. OBS: alternativamente, pode-se usar um anel de fase para objetiva de alta AN (100x) com uma objetiva de baixa AN. Campo escuro pode ser usada em luz transmitida e refletida e em estereoscopia.

Microscopia de campo escuro Dados técnicos: fatores que influenciam no tamanho do anel Posição do anel no condensador; AN da objetiva e do condensador; O número de campo da ocular; Aumento da ocular (menor aumento requer anel mais largo); Índice de refração do meio de montagem (maior IR requer anel mais largo).

Microscopia de campo escuro Dados técnicos do anéis Acessórios obrigatórios: opções de anéis de campo escuro.

Microscopia de campo escuro Dados técnicos- como fazer - realiza o alinhamento Koehler; seleciona o anel de campo escuro; movimenta-se o condensador verticalmente até obter o campo escuro e com a amostra brilhante. incorreto correto

Microscopia de campo escuro Técnicas e contraste Amostra Técnica Contraste Transparente Campo claro 2-5% Corada Campo claro 25% Transparente Contraste de fase 15-20% Transparente Contraste diferencial de interferência 15-20% Transparente Campo escuro 60-75% Transparente Fluorescência 60-75%

Microscopia de campo escuro Indicações Objetos muito pequenos, cuja visualização é difícil sobre um fundo claro; Pode permitir a detecção de estruturas muito menores que o poder de resolução do microscópio (ex.: 0.02 mm), mas isto não significa que a técnica aumenta a resolução. - Em combinação com técnica de fluorescência; Exemplos: - bactéria; - organelas celulares, polímeros, cílios, flagelos, microtúbulos, filamentos de actina; partículas de prata e ouro usadas em técnicas de histoquímica.

Microscopia de campo escuro Limitações amostras com muitos pontos de causam espalhamento podem não produzir um contraste adequado; estruturas que causam muito espalhamento podem mascarar outras estruturas mais delicadas que espalham pouca luz.

Microscopia de contraste de fase Imagens

Sal (cloreto de sódio) Raiz de dente humano Preparo por desgaste