Princípios de Genética Microbiana

Definição Genética (do grego genno; fazer nascer) É a ciência da hereditariedade e da variabilidade dos organismos. A variabilidade é uma característica necessária dos organismos vivos , tanto quanto sua constância.

Variabilidade em microrganismos A variabilidade está associada a duas propriedades: Genótipo: potencial total herdado Procariotos: cromossomo + qualquer DNA presente Eucariotos: cromossomo + DNA organelas (mitocôndrias e cloroplastos) Fenótipo: expressão de uma porção do genótipo. Condições ambientais também podem influenciar o fenótipo Ex. Azomonas spp. meio com sacarose: colônias mucosas e grandes meio sem sacarose: colônias secas e pequenas

A célula duplica o material genético antes da divisão celular Os microrganismos apresentam elevadas velocidades metabólicas. Em algumas horas várias gerações podem surgir Ex: E. coli: 3 gerações em 1 hora. clones

Podem surgir variantes, espontaneamente ou pela ação de fatores químicos ou físicos Mutantes resistentes crescendo dentro de uma zona de inibição

Variações no genoma microbiano 1) Mutações Alterações (hereditárias) na sequência de nucleotídeos de um gene. - Geralmente resultam em pequenas alterações genéticas (uma em vários milhões de células) 2) Recombinação genética Elementos genéticos contidos em dois genomas diferentes são reunidos numa unidade – nova combinação de genes. - Provoca alterações mais significativas.

1) Mutações Mecanismos: a) adição ou perda de nucleotídeos no gene As bactérias podem testar bilhões de mutações em pequenos intervalos de tempo. O ser humano deve levar cerca de 25 anos para testar uma mutação. Mecanismos: a) adição ou perda de nucleotídeos no gene (deslocamento do quadro de leitura) gera frequentemente proteínas não funcionais b) Substituição de nucleotídeos no gene (mutação pontual) proteína normal proteína incompleta proteína defeituosa (não funcional)

Mutações por substituição de nucleotídeos

Agentes mutagênicos - A frequência das mutações variam bastante e podem ocorrer espontaneamente - As que são muito frequentes criam dificuldade na manutenção dos bancos de culturas: Em culturas com 108 células/mL é provável de se encontrar vários mutantes Vários agentes podem aumentar a frequência das mutações: Químicos: análogos de bases, agentes que reagem com o DNA Físicos: radiações raios-X, luz UV Elementos transponíveis: Transposons

Agentes mutagênicos químicos Análogos de bases e substâncias que reagem com o DNA Brometo de etídio - Acridinas - Nitrosaminas - Nitrato de Sódio - Gás mostarda - Fenol e compostos fenólicos - Glutaraldeído - Esterilizantes quimicos gasosos (óxido de etileno, formaldeído) - Colquicina - Ácido nitroso (HNO3) - Aflatoxina B1 ....

Agentes mutagênicos Radiações As bases absorvem fortemente radiação UV (260 nm é a mais letal - UVC) - Ferramenta útil no obtenção e isolamento de mutantes. Radiações ionizantes causam efeito indireto - Produção de radicais livres a partir da água que reagem com as macromoléculas

Transposons Elementos mutagênicos constituídos do próprio DNA. - Pedaços móveis do DNA Ex: gene de resistência a um antibiótico Genes de transposição

Isolamento de mutantes Qualquer característica de um organismo pode ser modificada por meio de mutações. As mutações podem conferir ou não vantagem a um microrganismo. Mutações podem ser detectadas pela simples inspeção visual Mutantes resistentes a um antibiótico Mutantes pigmentados e despigmentados de Aspergillus nidulans Mutantes de Halobacterium que perderam a vesícula de gás.

Isolamento de mutantes Plaqueamento em réplica: quando o fenótipo dos mutantes não é facilmente reconhecível. Ex. mutantes nutricionais : Meio completo Meio mínimo

2) Recombinação genética Formação de um novo genótipo através da troca de material genético entre DNAs, geralmente entre espécies relacionadas. Nos eucariotos ocorre entre dois cromossomos homólogos durante a MEIOSE (fenômeno crossing-over). Nos procariotos a recombinação ocorre através de três processos: -Transformação, conjugação e transdução

1. Transformação: Griffith: 1928 Natureza: DNA livre Recombinação genética 1. Transformação: Griffith: 1928 Natureza: DNA livre (Evento marcante na biologia pois forneceu as primeiras evidências de que o DNA era o material genético)

Transformação Experimento de Griffith (1928) Experimentos com Streptococcus pneumoniae Experimento de Griffith (1928)

Transformação Naturalmente poucas bactérias realizam a transformação com eficiência. Entretanto, esse processo é comumente induzido, através da eletroporação utilizada na área da genética molecular.

Transformação Necessidade de células competentes: fase logarítmica final de crescimento e produção de proteína especial de ligação.

2. Conjugação Lederberg e Tatum (1946) Recombinação genética - Questionaram o senso comum de que bactérias somente produziam clones de si mesmas. - Experimentos delineados para determinar se as bactérias realizam processos sexuais. Requer contato entre células Transferência de plasmídeo ou cromossomo

Conjugação Experimento utilizando mutantes nutricionais de E. coli Lederberg & Tatum (1946)

Conjugação

3. Transdução Lederberg e Zinder (1951) vírus como vetor Recombinação genética 3. Transdução Lederberg e Zinder (1951) Estudava a conjugação em outras bactérias além da E. coli e percebeu que os eventos não necessitavam de contato intercelular, mas não era uma transformação. vírus como vetor

Transdução generalizada Baixa frequência de transferência Empacotamento acidental

Transdução especializada Luz ultravioleta Alta frequência de transferência

Regulação da expressão gênica Centenas de reações enzimáticas ocorrem durante um único ciclo de crescimento. Necessidade de regulação das atividades: - Melhor utilização dos recursos, menor dispêndio de energia. Mecanismos: Regulação da atividade enzimática Regulação da tradução Regulação da transcrição

Visão geral dos mecanismos de regulação gênica raro

1. Regulação da atividade enzimática Regulação alostérica (alterações na estrutura terciária da proteína)

A aspartato transcarbamoilase fornece N-carbamoil-aspartato para a rota de síntese de pirimidinas. É uma enzima alostérica inibida por CTP e ativada por ATP. Composta por 6 unidades regulatórias e 6 catalíticas. Carbamoil + PO4-2 aspartato N-Carbamoil + PO-4 H2 pirimidinas ativa inativa A ligação de CTP às subunidades regulatórias “fecha” o acesso aos sítios ativos nas subunidades catalíticas.

2. Regulação da transcrição (indução) Ex: utilização da lactose Operon: unidade completa de expressão gênica (lactose)

2. Regulação da transcrição (repressão) Processo amplamente distribuído nas bactérias, para controle na síntese de aminoácidos Ex: síntese de arginina