Avaliação da diversidade microbiana Amostragem, processamento e técnicas

Dificuldades na avaliação: Falta de recursos humanos capacitados Falta de financiamento Amplitude da diversidade Erosão da diversidade Falta de metodologias Porquê avaliar? Assegurar que microrganismos desempenhem processos necessários a produtividade e sustentabilidade. Assegurar que pelo menos alguns microrganismos sejam tolerantes a estresses.

Detecção e avaliação – técnicas: i. Fenotípicas ii. Moleculares Etapas da avaliação      Amostragem Processamento Detecção e avaliação – técnicas:          i.   Fenotípicas         ii.   Moleculares iii. Imunológicas

Coleta das amostras Etapa crítica São usados equipamentos especializados Devem ser considerados os seguintes fatores: Representatividade Não alterar os números e as atividades Evitar a introdução de contaminantes Estocar em condições adequadas

Problema da representatividade Uso de amostras compostas para minimização do erro Determinação do numero de amostras mínimo Estatística determinará os limites de confiança

Estratégias de amostragem Ar é um meio restritivo para os microrganismos (1) Acesso - direto Amostragem no Número de microrganismos - Baixo Ar Equipamentos (1) Apesar de restritivo transmite inúmeros agentes patogênicos Processamento - Concentração em filtros

Microbiota do Ar Morte dos microrganismos no ar Xt = X0-k.t Fatores: K- coeficiente de inativação Depende do tipo de microrganismo e das condições ambientais Fatores: Umidade relativa Temperatura Radiação (pigmentação, reparo do DNA) Radicais de O2 Íons, dentre outros

Os microrganismos alcançam o ar através dos aerossóis Depende do tipo de microrganismo, partículas e fase gasosa

Amostragem do ar 1.Simulação respiratória (tamanho partícula 0,8 – 15 μm; fluxo de ar e velocidade) 2. Colisão - Captura em liquido. Ex: AG-30 3. Impacto - deposição em superfícies sólidas. Ex: coletor de Anderson 4. Centrifugação 5. Filtração 6. Deposição - Coleta passiva

Coletor de Anderson AG-30

Equipamentos para amostragem do ar: Amostragem passiva Apenas microrganismos que caem nas placas Amostragem ativa Recuperação forçada usando um volume determinado

Método usado nas estações espaciais Dados NASA

Importância Aeromicrobiologia extramural: Dispersão de patógenos e toxinas (botulínica, estafilocócica, LPS) Fitopatógenos (ferrugem) Doenças pulmonares e gastro-intestinais de animais Despejo de resíduos (sólidos e líquidos) Guerra biológica Aeromicrobiologia intramural: Edificios (doenças dos Legionários-Legionella pneumophila, bactéria aquática disseminada pelos aparelhos de ar condicionado e água potável) Viagens de avião Saúde pública - gripes

Depende nível de matéria orgânica Acesso - Direto ou remoto Amostragem na Números - elevados ou baixos água Equipamentos -Recipientes, filtros Processamento - diluição ou concentração

Equipamentos ROV (Veículo operado de forma remota) usados nas águas hidrotermais Yellowstone Park Águas termais (difíceis de amostrar convencionalmente) Mensageiro controlado remotamente abre o recipiente para não ocorrer contaminação com microrganismos de outras profundidades

Sedimentos Amostragem em Acesso - Remoto Número de microrganismos - elevado Sedimentos Equipamentos - observatórios, sondas Processamento - diluição

Profundezas oceânicas mostrando as conexões entre a crosta e os sedimentos. Ocorrem trocas entre os sedimentos e a crosta. Um método efetivo de acesso ao sedimento enterrado é através de observatórios.

Microbiota dos sedimentos Observatórios penetrando 300 m nos sedimentos e crostas Cowen, 2004

Baixa abundância (biomassa) porém microrganismos sempre presentes Ventarolas marinhas Baixa abundância (biomassa) porém microrganismos sempre presentes Uso de sondas fluorescentes específicas para rRNA de Archaea e Bacteria e C radioativo para detectar atividade na crosta basáltica oceânica. Fisk et al., 1998

Sedimentos: Elevada diversidade de Bacteria e Archaea 180 reações metabólicas envolvendo N,S e C inorgânico, metais e minerais assim como compostos orgânicos Diversos micro-nichos existentes

Solo Acesso - direto Amostragem no Números de microrganismos - elevado ou baixo Solo Equipamentos - trados, pás Processamento - diluição

SOLO Uma simples pá de solo de jardim contem mais espécies de organismos do que pode ser encontrado em toda a floresta amazônica.

Problemas Heterogeneidade espacial solo 1-5 g solo Distribuição dos microrganismos em agrupamentos Elevada variabilidade entre amostras Tradicionalmente 1-5 g solo Estatística Bactérias existem em “hot-spots”

Solo propriamente dito Elevada população devido a riqueza nutricional da rizosfera. BIOMASSA - 1010 /g Características: 1. Microcolônias (interação ativa dentro das populações) 2. Estímulo ao crescimento (populações com elevadas velocidades crescimento) 3. Modificações ambientais 4. Troca genética Elevada diversidade governada pela Lei do Mínimo de Liebig. Subsolo BIOMASSA - 107/g SOLO Distribuição não homogênea

Alguns números sobre a estrutura do solo

Maioria diversidade é desconhecida! Microrganismos no solo Em cada grama solo tipicamente franco 2,8 X 105 m2 - dimensões continentais para microrganismos > 1X 1010 células viáveis > 4 X103 espécies << 0,1% são cultivadas in vitro Maioria dos grupos são conhecidos apenas por informações de sequenciamento de DNA Apenas 1 ou 2 membros cultivados pertencem a ordens conhecidas Maioria diversidade é desconhecida!

Números no solo Números de microrganismos no solo: Bactérias: 106 a 109 g-1 solo Gram - bacilos 17-29% Gram + bacilos 2-7% Actinomicetos: 11-32% Arthrobacter, etc., 31-46% Algas: 101 x 106 g-1 Fungos: 104 a 106 g-1 Protozoários : 104 a 105 g-1 Bacteriófagos: ? % Culturabilidade por grupo: 0.8 a 7 %

Solo Macrofauna e flora são relativamente fáceis de identificar e expressar usando riqueza especifica e outros índices. Mas no solo as estimativas da diversidade da microbiota : Envolvem dificuldades: heterogeneidade, grupos dificeis de cultivar em meio de cultura Estratégias Fame CHO utilização Técnicas moleculares usando PCR Sorologia

subsolo Amostragem no Populações - 107 /g Importantes patogênicos para homem subsolo

Importância Cerca de 40 % água consumida pelo homem provem do fontes subterrâneas Existem gradientes nestas regiões: Forçado - quando água é movimentada em elevadas quantidades produzindo a movimentação dos microrganismos Passivo - natural sem influência artificial Doenças causadas aumentou 40 % nos últimos 10 anos Vírus, bactérias e protozoários tem diferentes dimensões, metabolismos, mecanismos de sobrevivência e mecanismos de transporte diferenciados. Estudo da diversidade da microbiota da sub-superficie é muito complexa. Inúmeros trabalhos mostram a dificuldade de remediação de contaminantes nas águas subterrâneas. Processo dispendioso. 1 litro de petróleo pode contaminar 2.000 m3 de água

Movimentação da microbiota na sub-superfície

Microbiota da subsolo Como vivem? Pesquisada na última década (dificuldades de amostragem) Inúmeros aeróbios oligotróficos: 103-107/g Análise comunidades: Archaea e Bacteria (muitas BRS) Metanogênicas (CO2) CH4 Acetogênicas (HCO3-) acetato Bactérias redutoras de sulfatos (BRS) (SO4-2) sulfídrico H2 é gerado pelo FeO+H2O H2+FeO2 Como vivem? Quimioautotróficos e Quimiolitotróficos

Sedimentos profundos 1. Número de bactérias cultiváveis em sedimentos foi cerca de 3 ou 5 ordens de magnitude (1000 a 100.000 x) MENOR do que em solos superficiais.   2. Camadas areia-água apresentaram contagens e atividade mais elevadas, do que as camadas argilosas perto da superfície.  3. Profundidade não é necessariamente limitante ao crescimento e atividade. 4. Estudo enumerou coliformes, redutores de sulfato e metanogênicas: - Atividade anaeróbia medida pelo desaparecimento de lactato, formato e acetato e produção de metano e H2S. Sedimentos não incluem apenas anaeróbios, sendo inclusive de 100 a 100.000 vezes menos do que os aeróbios.   - Número de coliformes baixou drasticamente com a profundidade, mas estão presentes nos fluidos dos poços.

A 3,4 Km abaixo da superfície Microbiota da subsolo Como sobrevivem? A 3,4 Km abaixo da superfície Possibilidades: 1. Foram incorporados nos sedimentos durante a formação das rochas há milhões de anos e sobrevivem em condições nutricionais de “dieta mínima”. 2. Infiltraram as águas subterrâneas a partir de águas de superfície (maioria das bactérias que ocorrem em rochas como basalto e granito) 3. Crescem lentamente a partir de fontes de energia inorgânicas fornecendo carbono orgânico para outros microrganismos na matriz rochosa (SLiME - Subsurface Lithautotrophic Microbial Ecosystems).

Recentemente descobertos Subsolo Recentemente descobertos A. 1-10 microrganismos /g de rocha (10-9 /g de solo superficial rizosférico) B. Densidade das comunidades é desconhecida: - Metabolismo microbiano é lento (dificuldade distinguir viável de inviável) - Células inviáveis são fonte nutricional para células viáveis (baixo movimento de água e nutrientes) - Difícil reproduzir as condições das profundezas em laboratório - Recentemente 9000 estirpes do subsolo foram catalogadas. - Peso dos microrganismos subterrâneos pode ser equivalente aos da superfície.

Biológicas Amostras Plantas - seiva, filosfera Não destrutivas Plantas - seiva, filosfera Amostras Animais - sangue, dentes Biológicas Interação microrganismos - macrorganismos

Processamento Objetivo: recuperação ótima Problemas: Porosidade dos filtros Composição quimica Concentração - centrifugação e passagem por filtros Microrganismos encontram-se em números inapropriados (elevados ou baixos) e em comunidades (diversas espécies) Enriquecimento Problemas: Composição do diluente Tempo de mistura Grau de agitação Diluição - Diluições seriadas

Enriquecimento Seleção natural aplicada in vitro Para microrganismos que metabolizam uma determinada substância ou que ocorrem em baixas populações na amostra. Desenvolvidas por Beijerinck Cultura de enriquecimento consiste na promoção de condições favoráveis especí.ficas para o crescimento de um tipo particular de microrganismo. Exemplo 1: para isolar um fixador de nitrogênio o meio de enriquecimento não poderá conter uma fonte de nitrogênio. Exemplo 2: bactéria que degrada naftaleno deve-se cultivar a amostra em um meio cuja única fonte de C é o naftaleno. Exemplo 3: coluna de Winogradsky, enriquecimento para quimilitotróficos. Exemplo 4: Para isolar Bacillus formadores de esporos aquecer a cultura mista e plaquea. Seleção natural aplicada in vitro

Detecção dos microrganismos Métodos: Fenotípicos - baseadas no cultivo ou avaliação de certas propriedades do microrganismos Moleculares - baseadas na constituição genotípica Imunológicos - baseadas nas características imunológicas

Fenotípicos Métodos baratos e não requerem treinamento diferenciado Amplificação de sinal: CULTIVO EM MEIO DE CULTURA Técnicas morosas Em alguns sistemas não são precisas Isolamento cultura pura identificação

Plaqueamento Diluição seriada Amplificação sinal fenotípico colônias

Cultivo Ex: Geobacter metallireducens: CH3COO - + 8Fe3+ + 4H2O 2HCO3- + 8Fe 2++ 9H+ Adicionar acetato como única fonte de C no meio de cultura permite a detecção de microrganismos que podem metabolizar acetato e usam oxido de ferro como fonte de energia Crescer microrganismos em laboratório com base em características fenotípicas. Detectar grupos que usam determinada substância ou fonte energética e que vivem em determinadas condições físico-químicas.

Corantes vitais e Imunofluorescência

Técnica não envolve cultivo Perfil lipídico Técnica não envolve cultivo

Perfil de FAME (Fatty acids methyl ester analysis) Existe grande variabilidade no perfil da composição e proporção de ácidos graxos (membranas). Perfil FAME = impressão de uma espécie 2. Usado no estudo da diversidade microbiana em sistemas de tratamento de esgoto, em solos contaminados e biofilmes de sistemas de distribuição de água.

Requerem vastas livrarias Outras técnicas fenotípicas Requerem vastas livrarias MARA - multiple antibiotic resistance activity ARA - antibiotic resistance analysis CSU - carbon source utilization Detecção de hospedeiros de vírus

Avaliação da abundância relativa Enumeração Biomassa Atividade Contagem direta Contagem indireta

Contagem direta Lâmina Petroff-Hauser ao microscópio Fluorecência, anticorpos Vantagens: Não requerem separação do microrganismo. Fornecem estimativas elevadas Desvantagens: Não distingue entre viáveis e não viáveis. Não permite análises subsequentes

Lâminas para contagem direta

Contagem indireta Contagem em placas NMP Técnica de Diluição e plaqueamento

Diluições seriadas (resultado)

Enumeração NMP

NMP – número mais provável

Contagens indiretas Vantagens: -Detecção de viáveis -Seletividade (uso de meios específicos) Desvantagens: - Seletividade permite a contagem de alguns tipos - Ausência de não cultiváveis

Avaliação da biomassa Parâmetro importante porque avalia os recursos energéticos disponíveis para a comunidade. Expresso em g e pode-se converter em energia: 4,9 Kcal/g peso seco Direta Filtração Centrifução Pesagem Indireta Proteína Peptideoglicano Quitina LPS DNA Dentre outros Baseia-se no fato de existir uma correlação direta entre a abundância de um microrganismo com alguma substância característica.

Avaliação da atividade Fotossíntese – taxa de produção primária Respiração - consumo de O2 ou produção de CO2 Potencial heterotrófico - taxa de absorção de substâncias marcadas com radioisótopos Atividade enzimática - lacase, celulase, nitrogenase

Viáveis mas não cultiváveis (VNC) < 1% dos microrganismos podem ser cultivados no laboratório usando técnicas convencionais de cultivo. Os microrganismos que não são cultiváveis, mas são viáveis, se denominam VNC e requerem técnicas apropriadas para sua detecção. Ex: Fungos micorrízicos vesículo-arbusculares.