TRADUÇÃO SÍNTESE PROTEICA

DNA Replicação Transcrição reversa Transcrição RNA Tradução Proteína

Código genético 3 bases nitrogenadas 1 amino ácido Fluxo da Informação Genética Código genético 3 bases nitrogenadas 1 amino ácido

Marcos no metabolismo de proteínas 1. ~1950- síntese proteica em pequenas partículas de ribonucleoproteínas (Paul Zamecnik- fracionamento celular, radioativo)- ribossomos 2. aminoacil-tRNA sintetases- tRNA, ATP Hoagland & Zamecnick) 3. hipótese do adaptador (tRNA, anti-codon Francis Crick)

Síntese proteica ~300 moléculas envolvidas ~90% da energia gasta nos processos biossintéticos Bactérias: ~35% do peso: 20.000 ribossomos, 100.000 proteinas (fatores e enzimas), 200.000 tRNAs Processo rápido: ~20 resíduos/seg Erro: 1 a cada 10.000 aa adicionados

Síntese e Processamento de Proteínas Transcrição Processamento pós-traducional Transcrito primário Processamento pós-transcricional mRNA maduro Modificações covalentes nos aminoácidos Tradução Dobramento Proteína (inativa) Proteína ativa

Código genético (degenerado)

Outras seqüências de mRNA podem especificar a mesma seqüência de aminoácidos

Código genético alternativo em mitocôndrias

Troca de “frame” Virus (sarcoma de Rous): gag e pol (1/20) Gag: ... ACA AAU UUA UAG GGA GGG Pol: .... ACA AAU UUAUA GGG AGG

Código genético Códon de iniciação- AUG (raro- GUG, UUG) Códon de terminação- UAA, UAG, UGA

RNAs Tipo Tamanho Função tRNA Pequeno Transporte de aa para o local de síntese rRNA Diversos Forma os ribossomos, juntamente com proteínas mRNA Determina a sequência de aa na prteína snRNA Processa o mRNA inicial nos eucariotos miRNA Afeta a expressão gênica (crescimento, desenvolvimento) siRNA pequeno Afeta a expressão gênica. Cientistas utilizam para bloquear a expressão do gene de interesse

tRNA

O ribossomo acomoda dois tRNAs carregados

Etapas da síntese de proteínas 1. Ativação do aminoácido 2. Iniciação 3. Elongação 4. Terminação 5. Dobramento/processamento pós-tradução

Aminoacil tRNA sintetase Aminoacil tRNA sintetase 1. Ativação do aminoácido Aminoacil tRNA sintetase ATP + aa aminoacil-AMP + Ppi aminoacil-AMP + tRNA aminoacil-tRNA + AMP Aminoacil tRNA sintetase

Aminoacil tRNA sintetase 1. Ativação do aminoácido Aminoacil tRNA sintetase aminoacil-AMP

Classe I Classe II aminoacil-AMP aminoacil-tRNA

Ligação do aminoácido ao tRNA 1. Ativação do aminoácido Ligação do aminoácido ao tRNA Aminoacil t-RNA A etapa de ativação do aminoácido é determinante na fidelidade da tradução

2. Iniciação (bactéria) Ribossomo bacteriano reconhece uma sequência no mRNA- Shine Delgarno

Nas bactérias, o primeiro amino ácido é formil-metionina fMet-tRNAf tem características que o distinguem como tRNA iniciador (tRNAi) Só tRNAi liga no sítio P e ao fator de iniciação (IF1 ou IF2) Eucariotos- primeiro aa é metionina

Adição do grupo formil no metionil-tRNAf: dependente de ácido fólico H Adição do grupo formil no metionil-tRNAf: dependente de ácido fólico tRNA para formil-metionina é diferente da tRNA para metionina

3. Elongação AA2

Peptidil-transferase- 23S? Sítio E- bactéria

Translocação

4. Terminação Proteínas de terminação (RFs): diferentes de acordo com o códon de terminação (bactérias) RFs- estrutura semelhante aos tRNAs, mas ligam em regiões distintas nos ribossomos Túnel de saída do ribossomo para a proteína- 12- 20 Å

Polissomo :10-100 ribossomos

Fatores proteicos necessários para iniciação da tradução Bactéria: IF-1 – Previne ligação prematura dos tRNAs ao sítio A IF-2 – Facilita ligação do fMet-tRNAf a subunidade 30S (liga GTP) IF-3 – Liga suunidade 30S e previne associação prematura da subunidade 50S. Aumenta especificidade do sítio P pelo fMet-tRNAf Eucariotos: eIF1- Liga mRNA eIF2 –Facilita ligação do Met-tRNAi a subunidade 40S (liga GTP) eIF2B, eIF3 – Ligam subunidade 40S/ mRNA eIF4A – Helicase de RNA para remover estrutura secundária do mRNA eIF4B – Liga mRNA, facilita varredura para localizar o primeiro AUG eIF4E – Liga 5´cap do mRNA eIF4G – Liga e IF4E e protéina que liga cauda poliA (PAB) eIF5 – Promove dissociação de outros fatores para facilitar associação de 60S eIF6 – Facilita dissociação de 80S inativo em 40S e 60S

Processamento após (ou durante) a síntese de proteínas Dobramento (Folding) Clivagem proteolítica (incluindo amino-terminal) Modificações covalentes nos aminoácidos Degradação Influencia a estrutura e função de proteínas

20 aminoácidos diferentes ~200 aminoácidos diferentes Modificações covalentes nos aminoácidos (modificações pós-traducionais): Ex: Metilação Acetilação Hidroxilação Glicosilação Fosforilação Grupos prostéticos Acilação ~200 aminoácidos diferentes (modificados covalentemente)

Fosforilação Fosfo-serina Fosfo-treonina Fosfo-tirosina Modulação da atividade de proteínas, modulação de interações moleculares, sinalização celular Fosfo-serina Fosfo-treonina Fosfo-tirosina Fosfo-histidina

Glicosilação Os carboidratos são ligados aos resíduos de aminoácidos através de ligações N- ou O- glicosídicas Glycoproteins Membrane associated carbohydrate is exclusively in the form of oliogsaccharides covalently attached to proteins forming glycoproteins, and to a lesser extent covalently attached to lipid forming the glycolipids. Glycoproteins consist of proteins covalently linked to carbohydrate. The predominant sugars found in glycoproteins are glucose, galactose, mannose, fucose, GalNAc, GlcNAc and NANA. The distinction between proteoglycans and glycoproteins resides in the level and types of carbohydrate modification. The carbohydrate modifications found in glycoproteins are rarely complex: carbohydrates are linked to the protein component through either O-glycosidic or N-glycosidic bonds. The N-glycosidic linkage is through the amide group of asparagine. The O-glycosidic linkage is to the hydroxyl of serine, threonine or hydroxylysine. The linkage of carbohydrate to hydroxylysine is generally found only in the collagens. The linkage of carbohydrate to 5-hydroxylysine is either the single sugar galactose or the disaccharide glucosylgalactose. In ser- and thr-type O-linked glycoproteins, the carbohydrate directly attached to the protein is GalNAc. In N-linked glycoproteins, it is GlcNAc

Endereçamento de proteínas

Peptídeo sinal direciona proteínas secretadas e/ou glicosiladas para o retículo endoplasmático (ER)

Síntese de proteínas acoplada ao ER

Glicosilação Os carboidratos são ligados aos resíduos de aminoácidos através de ligações N- ou O- glicosídicas Glycoproteins Membrane associated carbohydrate is exclusively in the form of oliogsaccharides covalently attached to proteins forming glycoproteins, and to a lesser extent covalently attached to lipid forming the glycolipids. Glycoproteins consist of proteins covalently linked to carbohydrate. The predominant sugars found in glycoproteins are glucose, galactose, mannose, fucose, GalNAc, GlcNAc and NANA. The distinction between proteoglycans and glycoproteins resides in the level and types of carbohydrate modification. The carbohydrate modifications found in glycoproteins are rarely complex: carbohydrates are linked to the protein component through either O-glycosidic or N-glycosidic bonds. The N-glycosidic linkage is through the amide group of asparagine. The O-glycosidic linkage is to the hydroxyl of serine, threonine or hydroxylysine. The linkage of carbohydrate to hydroxylysine is generally found only in the collagens. The linkage of carbohydrate to 5-hydroxylysine is either the single sugar galactose or the disaccharide glucosylgalactose. In ser- and thr-type O-linked glycoproteins, the carbohydrate directly attached to the protein is GalNAc. In N-linked glycoproteins, it is GlcNAc

Puromicina: estrutura similar a extremidade 3’ do aminoacil-tRNA, ocorrendo a formação de peptidil-puromicina e interrupção da síntese proteica

Causa leitura incorreta dos códons e inibe iniciação Inibição da síntese proteica por antibióticos e toxinas Estreptomicina Causa leitura incorreta dos códons e inibe iniciação Tetraciclina Bloqueia o sítio A do ribossomo bacteriano e inibe associação do aminoacil-tRNA

Bloqueia atividade de peptidil transferase do ribossomo eucariótico Inibição da síntese proteica por antibióticos e toxinas Cloranfenicol Bloqueia atividade de peptidil transferase de ribossomos bacterianos e mitocondriais Cicloheximida Bloqueia atividade de peptidil transferase do ribossomo eucariótico

Inibição da síntese proteica por antibióticos e toxinas Toxinas proteicas que inibem a tradução: Toxina da difteria: inativa o fator eEF2 (ADP-ribosila histidina) Ricina : inativa a subunidade 60S (depurina uma adenosina do rRNA 23S)

Nucleoide (DNA compactado) Envelope celular (membrana) Ribossomos Nucleoide (DNA compactado) Pili Flagelo Envelope celular (membrana)

Informação genética- DNA nuclear nos eucariotos Ribossomos Núcleo Envelope nuclear Ribossomos Mitocondrias Cloroplasto

A T G C

T A C A

Estrutura do DNA

DNA fita dupla: cadeias antiparalelas

Decifrando o Código Genético 1.Quantos nucleotídeos seriam necessários? 4 nucleotídeos diferentes no DNA 20 aminoácidos diferentes na proteína Código de um nucleotídeo = 4 combinações Código de dois nucleotídeos (42) = 16 combinações Código de três nucleotídeos (43) = 64 combinações

Decifrando o Código Genético 2.O código não é superposto ABCDCD aa1 aa2 aa3 aa4 Análise da seqüência de aminoácidos de mutantes da proteína da capa do vírus mosaico do tabaco mostraram que o código não era superposto. A mutação em um nucleotídeo leva a mudança de um aminoácido e não de três aminoácidos

Decifrando o Código Genético 3.O código não tem pausas Fase de leitura 1 Fase de leitura 2 Fase de leitura 3 5’ A U G C A C U U U A C U A A O código é lido sequencialmente sem pausas a partir do início determinado (3 fases de leitura são possíveis).

Decifrando o Código Genético 4. O código é degenerado 64 códons para codificar 20 aminoácidos??? 61 códons codificam 20 aminoácidos. Para a maioria dos aminoácidos há mais de um códon 3 códons não codificam aminoácidos. São códons de terminação da síntese de proteínas

Decifrando o Código Genético 5. Como o código foi decifrado? Tanto as sequências de bases do DNA com a de aminoácidos das proteínas eram desconhecidas!!! Nirenberg em 1961 mostrou que a adição de o RNA sintético poliuridilato (poli U) em um sistema de síntese proteíca livre de células (extrato de E.coli) levava a síntese de polifenilalanina: UUU = Phe Poli U foi sintetizado in vitro pela polinucleotídeo fosforilase...

Síntese das proteínas da célula Tradução Síntese das proteínas da célula - Ocorre nos ribossomos Direção da Tradução Direção da Transcrição Ribossomo Nas bactérias, transcrição e tradução estão acopladas....