CRYPTOSPORIDIUM PONTOS CHAVES PARA O DIAGNÓSTICO LABORATORIAL I PRINCÍPIOS BÁSICOS: a) Amostras fecais múltiplas (ao menos 3)* devem ser testadas antes de ser considerada uma interpretação de diagnóstico negativa. b) Para maximizar a recuperação de oocistos, amostras fecais devem ser concentradas antes do exame microscópico (por exemplo, centrifugação a 500 X g, 10 min, por método da formalina-acetato de etila). Amostras a serem processadas pelo teste imunoenzimático não devem ser concentradas, pois antígenos se perderão durante o procedimento! c) A escolha das técnicas diagnósticas depende da disponibilidade de equipamentos e reagentes, experiência e considerações quanto a tempo e custo dos exames. Os métodos mais freqüentemente usados incluem: 1. TESTE DE ANTICORPO FLUORESCENTE DIRETO (Imunofluorescência = IF): Oocistos (4-6 µm) adquirem fluorescência verde-maçã. Esta técnica oferece a mais alta combinação de sensibilidade e especicidade e é considerada o “padrão ouro” por muitos laboratórios. Entretanto, ela não proporciona um registro permanente como o faz a lâmina corada que pode ser arquivada, além de requerer equipamento especial (microscópio fluorescente) e a compra de reagentes comercialmente disponíveis. 2. TESTE IMUNOENZIMÁTICO (ELISA): As amostas não devem ser concentradas antes de serem testadas. Antígenos de Cryptosporidium são detectados nas fezes por este método (Amostras positivas próximas ao limiar de reatividade precisam ser confirmadas por IF). O ELISA não depende de prática em microscopia, tem elevada sensibilidade e especificidade, e é util em levantamentos com grande número de amostras em curto espaço de tempo. Entretanto, ele exige equipamento especial (Leitor de microplacas) e aquisição de reagentes comercialmente disponíveis. 3. COLORAÇÃO DE KINYOUN (ZIEHL-NEELSEN MODIFICADA): Oocistos (4-6 µm) frequentemente se apresentam com sua parede evidente e se coram de rosa claro a vermelho brilhante. Entretanto, a coloração pode ser variável: infecções em fase de recuperação, em particular, podem ter oocistos “fantasmas” não corados. Oocistos maduros podem ter esporozoitas visíveis (até 4). Este método é o mais fácil e prático e proporciona obtenção de registro permanente. Erros de diagnóstico podem acontecer, todavia, em decorrência da variabilidade nas colorações e confusão com artefatos. *O conceito de uso de multiplas amostras de fezes está atualmente sobre revisão. Alguns estudos tem mostrado que a primeira amostra é suficiente para proporcionar diagnósticos precisos em 90% dos casos. Oocistos de Crryptosporidium parvum (seta) e cistos de Giardia intestinalis (à direita) corados com anticorpos fluorescentes. Esfregaço de fezes contendo oocistos de Cryptosporidium parvum corados pela técnica de Kinyoun (álcool-ácido-resistente modificado)

CRYPTOSPORIDIUM PONTOS CHAVES PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL II 4. COLORAÇÃO PELA SAFRANINA: Oocistos de Cryptosporidium freqüentemente (mas não sempre) adquirem uma coloração vermelho-alaranjada brilhante. Este método, recomendado para Cyclospora, não é muito usado para Cryptosporidium, pois os oocistos de Cryptosporidium nem sempre se coram. 5. MONTAGEM A FRESCO: Em microscópio de campo claro, oocistos aparecem como pequenas estruturas arredondadas (4 - 6 µm) semelhantes a leveduras. Eles não apresentam autofluorescência. Este método é menos útil para Cryptosporidium que para Cyclospora, especialmente quando pequeno números de oocistos podem ser confundidos por outros elementos fecais.   6. COLORAÇÃO PELO TRICRÔMIO (ou tricromo): Oocistos aparecem como pequenas estruturas redondas medindo de 4 a 6 µm. A coloração pelo tricrômio é uma técnica de coloração permanente de rotina para amostras de fezes na maioria dos laboratóiros, e os técnicos devem estar familiarizados com a aparência do Cryptosporidium corado com tricromo. Este método de coloração é, entretanto, inadequado para diagnóstico definitivo, pois os oocistos aparecerão não corados, dificultando o estudo morfológico. O método de Kinyoun (álcool-ácido-resistente modificado) é um método de coloração facil e o mais prático para realização de um diagnóstico acurado. DIFERECIAÇÃO ENTRE OOCISTOS DE CYCLOSPORA vs CRYPTOSPORIDIUM  Tamanho: Cyclospora 8-10 µm; Cryptosporidium 4-6 µm. Esporozoítas: não visíveis no interior de oocistos de Cyclospora, podem sre discerníveis nos oocistos de Cryptosporidium Autofluorescência: presente no Cyclospora, ausente no Cryptosporidium. Teste de Anticorpo Fluorescente Direto: disponível para Cryptosporidium. Teste Imunoenzimático (ELISA): disponível para Cryptosporidium. Esfregaço de fezes contendo oocistos de Cryptosporidium parvum corados pela técnica de coloração pela safranina.