Análise Computacional de Seqüências Nucleotídicas e Protéicas BLAST Antonio Basílio de Miranda 24/11/2004 Adaptado por Marcos Catanho 10/05/2005

As Origens... Rigorous Dynamic Programming: Needleman & Wunsch (1970) Smith & Waterman (1981) Heuristics: Lipman & Pearson (1985,1988) Altschul et al. (1990,1997)

BLAST - Basic Local Alignment Search Tool Provavelmente a ferramenta computacional mais utilizada em biologia molecular e bioinformática Busca seqüências armazenadas nos bancos de dados pela similaridade entre a estrutura primária da seqüência query e as seqüências armazenadas no banco Propriedades biológicas descritas para seqüências armazenadas podem ser transferidas para a seqüência query desde que suas estruturas primárias sejam semelhantes O maior problema é definir um cut-off, um limite abaixo do qual as similaridades encontradas entre a query e os hits não sejam mais significativos

BLAST É um método heurístico para alinhamentos locais Projetado especialmente para buscas em bancos de dados Idéia básica: bons alinhamentos irão conter pequenos trechos de combinações iguais

BLAST Existem vários “sabores” e tipos de BLAST: Nucleotídeo Proteína Traduzido Genomas

BLAST Nucleotídeo: Nucleotídeo-nucleotídeo (blastn) Megablast Megablast descontínuo Busca por hits curtos e quase perfeitos Busca em cromatogramas

BLAST Proteína: Proteína-proteína (blastp) Busca através da obtenção de perfis (PHI- BLAST e PSI-BLAST) Busca por hits curtos e quase perfeitos Busca em bancos de dados de domínios conservados (Smart, PFam e COG) (rps- blast) Busca pela arquitetura de domínios (cdart)

PHI-BLAST e PSI-BLAST PHI-BLAST: Em quais outras seqüências protéicas há ocorrência do padrão P e ao mesmo tempo estas seqüências são similares à query P na vizinhança do padrão? PSI-BLAST: Construção de uma matriz de valores posição-específica (Position Specific Scoring Matrix, PSSM)

BLAST Traduzido: query traduzida x banco de dados de proteínas (blastx) query de proteína x banco de dados traduzido (tblastn) query traduzida x banco de dados traduzido (tblastx)

BLAST Genomas: Galinha, vaca, porco, cachorro, ovelha, gato Amostras ambientais Homem, camundongo, rato Fugu rubripes, zebrafish Insetos, nematódeos, plantas, fungos, malária Genomas microbianos, outros genomas eucarióticos

BLAST - algoritmo 1. Filtrar as regiões de baixa complexidade 2. Fragmentar a seqüência query e as seqüências depositadas no banco de dados, criando “palavras“ (de comprimento 3 para proteínas e 11 para DNA) através do uso de uma janela deslizante MEF EFP FPG PGL GLG MEFPGLGSLGTSEPLPQFVDPALVSS

BLAST - algoritmo 3. Utilizando uma matriz de substituição (PAM, BLOSUM), encontrar todas as “palavras” de tamanho W que obtenham, no mínimo, um n o. de pontos (score) T quando comparadas com a seqüência query, criando uma lista de “palavras” de alta pontuação

(Parênteses – matrizes de substituição) É uma matriz representando todas as possíveis trocas entre aminoácidos, onde um valor é atribuído a cada uma destas trocas Esses valores são proporcionais à probabilidade de ocorrência de cada troca, tomando-se como base um determinado modelo evolutivo

(Parênteses – matrizes de substituição)

PAM family: Baseiam-se em alinhamentos globais de proteínas muito próximas PAM1 é a matriz calculada a partir da comparação de seqüências com não mais do que 1% de divergência As demais matrizes PAM são extrapolações da PAM1 BLOSUM family: Baseiam-se em alinhamentos locais de proteínas BLOSUM 62 é a matriz calculada a partir da comparação de seqüências com não menos do que 62% de divergência Todas as matrizes BLOSUM baseiam-se em alinhamentos observados; não há extrapolações

BLAST - algoritmo 4. Procurar em cada seqüência depositada no banco de dados por uma ou mais ocorrências de cada “palavra” de alta pontuação. Cada uma destas ocorrências (hit) será uma “semente” para um alinhamento sem gaps 5. Estender os hits em ambas as direções, na tentativa de gerar alinhamentos com score acima de um limiar S

BLAST - algoritmo 5.1. BLAST original: extensão dos hits à esquerda e à direita da “semente”, sem gaps. Esta extensão irá continuar enquanto o score aumentar ou pelo menos continuar o mesmo. O alinhamento obtido é chamado HSP (High Scoring Pair) 5.2. Atualmente: hits ao longo da mesma diagonal (Dot plot) com uma distância A entre os dois são reunidos e a extensão se dá com a seqüência maior obtida

(Parênteses – Dot Plots - matrizes de homologia)

BLAST - algoritmo 6. Reter somente os HSPs com score acima do limiar S 7. Determinar a significância estatística de cada alinhamento remanescente (p- value e E-value) 8. Mostrar os alinhamentos locais (de acordo com Smith-Waterman)

Resultado (BLASTN)

Resultado (campo de busca)

Resultado (opções)

Resultado (formato)

Resultado (BLASTN) O output é dividido em cinco partes: 1. Header contendo a versão do BLAST, data da compilação, referência, RID, etc. 2. Representação gráfica dos alinhamentos 3. Sumário com uma descrição em uma linha de cada hit 4. Os alinhamentos com seus respectivos parâmetros calculados 5. Rodapé com a descrição detalhada dos parâmetros de busca empregados, o banco de dados, etc.

Resultado (header)

Resultado (graphical overview)

Resultado (one-line descriptions)

Resultado (links) G: Gene U: UniGene E: GEO Profile (dados de expressão gênica e hibridização genômica obtidos por tecnologia high-throughput)

Resultado (alignments)

HSPs

Resultado (footer)

CDART