Clustal-W Oscar Miranda

Conteúdo Problema Características A ferramenta Algoritmos Referências ClustalW 17/06/2001

Alinhamento Múltiplo Comparando Várias Seqüências Visualmente Manter bases conservadas -----GC-GATAG---- CAGTCGCTGATCGTACG Quantificando a qualidade de um alinhamento Tratamento de gaps e substituições ClustalW 17/06/2001

Para quê? Encontrar padrões que caracterizam famílias de proteínas Detectar ou demonstrar homologia entre novas seqüências e famílias de seqüências existentes Ajuda a predizer as estruturas secundárias e terciárias de novas seqüências Sugerir oligonucleotídios primários para PCR Análise da evolução molecular ClustalW 17/06/2001

Comparando Várias Seqüências Caso geral do alinhamento de entre 2 seqüências O(n2 ) Alinhamento Ótimo Programação dinâmica O(k22knk) NP-completo Tree Alignment Qualidade aceitavel Rápido para poucas seqüências Outras Heurísticas Busca em base de dados ClustalW 17/06/2001

Clustal-W: A ferramenta Disponível gratuitamente Código aberto Várias plataformas Parâmetros definidos pelo usuário Reconhece automaticamente vários formatos NBRF/PIR, EMBL/SWISSPROT, Pearson (Fasta), Clustal (*.aln), GCG/MSF (Pileup), GCG9/RSF e GDE flat file. Clustal-X Versão mais amigável Alinhamento colorido Ajuda/explicação de parâmetros ClustalW 17/06/2001

Processo Dividido em 3 passos Matriz de distâncias Geração da árvore Alinhamento ClustalW 17/06/2001

Processo: Passo 1 Passo 1 É gerada a matriz de distâncias Todas as seqüências são comparadas par a par Dois métodos: Fast Approximate method Rápido Full dynamic programming Eficaz mas lento default ClustalW 17/06/2001

Processo: Passo 1 Programação dinâmica Alinha todas as seqüências par a par Algoritmo de Myers e Miller modificado Usa Matriz de pesos Proteínas: PAM, BLOSUM, GONNET DNA: IUB(bestfit), clustal Parâmetros GAP Abertura de gap: GOP Extensão de gap: GEP ClustalW 17/06/2001

Algoritmo de Myers e Miller Espaço linear Cálculo do escore em espaço linear Cada elemento da matriz é calculado com apenas 3 vizinhos ClustalW 17/06/2001

Algoritmo de Myers e Miller ClustalW 17/06/2001

Algoritmo de Myers e Miller Dividir para conquistar Encontrar na linha do meio o ponto que faz parte do alinhamento ClustalW 17/06/2001

Algoritmo de Myers e Miller Path(i1,j1, i2, j2) midi = (i1+i2)/2 S+ <- alinhamento(i1, j1, midi, j2); S* <- alinhamento_reverso(midi, j1, i2, j2); midj = j entre j1 e j2 tal que S+[j] + S*[j] é máximo path(i1, j1, midi, midj); path(midi, midj, i2, j2); ClustalW 17/06/2001

Matriz de Distância S1 S2 S3 S4 S5 - 87 77 62 90 55 66 >S1 ATCTCGAGA >S2 ATCCGAGA >S3 ATGTCGACGA >S4 ATGTCGACAGA >S5 ATTCAACGA S1 S2 S3 S4 S5 - 87 77 62 90 55 66 ClustalW 17/06/2001

Processo: Passo 1 Fast Approximate Algoritmo de Wilbur e Lipman Alinhamento Aproximado O(n + m + M2) M: número de fragmentos ClustalW 17/06/2001

Algoritmo de Wilbur e Lipman Seleciona os fragmentos onde cada fragmento é uma tripla (i,j,k) tal que as k-tuplas de símbolos das duas seqüências casam; xi=yj, xi+1=yj+1,...,xi+k=yj+k O(n+m+M) Um fragmento (i’,j’,k’) é dito abaixo(i,j,k) se i+k<=i’ e j+k<=j’; Quando as substring no fragmento (i’,j’,k’) aparecem estritamente depois das de (i,j,k) nas strings de entrada. O tamanho do fragmento (i,j,k) é k. A diagonal do fragmento (i,j,k) é o número j – i e a diagonal reversa é i + j; ClustalW 17/06/2001

Algoritmo de Wilbur e Lipman Um alinhamento de fragmentos é definido como uma seqüência de fragmentos tais que, se (i,j,k) e (i’,j’,k’) são fragmentos adjacentes na seqüência, ou (i’,j’,k’) está abaixo de (i,j,k) em uma diagonal diferente(um gap), ou os dois fragmentos estão na mesma diagonal, com i’> i(mismatch). ClustalW 17/06/2001

Matriz de Distância 2 Programação dinâmica Fast-Approximate S1 S2 S3 62 67 50 78 80 44 S1 S2 S3 S4 S5 - 87 77 62 90 55 66 Fast-Approximate Programação dinâmica ClustalW 17/06/2001

Processo: Passo 2 Construção da árvore a partir da matriz de distâncias Usada como guia para o próximo passo Método Neighbour-Joining Gera arquivo que pode ser visualizado posteriormente ClustalW 17/06/2001

Método Neighbor-Joining Saitou and Nei (1987) Algoritmo guloso Inicia Com uma Árvore Estrela A cada iteração junta os dois nós da raiz os quais a soma das divergências de cada para o resto da árvore seja mínimo Estima o tamanho do novo nó a partir dos valores de divergência dos nós escolhidos ClustalW 17/06/2001

Exemplo Neighbor-Joining S1 S2 S3 S4 S5 - 87 77 62 90 55 66 ClustalW 17/06/2001

Processo: Passo 3 Alinhamento Progressivo baseado na árvore filogenética Feng e Doolittle Diferentes Penalidades para GAP Opção para modificar valores iniciais Valores atualizados durante o processo Utiliza o Algoritmo de Myers e Miller modificado para o alinhamento do consenso ClustalW 17/06/2001

Tratamento de GAPs Parâmetros iniciais dados pelo usuário Abertura de gap(GOP) e extensão de gap(GEP) GAPs terminais não tem custo Escolha dos valores automaticamente durante o processo de alinhamento ClustalW 17/06/2001

GAP: valores iniciais 1) GOP dependente da matriz de pesos utilizada Variar a penalidade dos gaps de acordo com diferentes matrizes melhora a qualidade. 2) Dependência no grau de similaridade das seqüências Uso do percentual de semelhança entre seqüências para aumentar ou diminuir o GOP. ClustalW 17/06/2001

GAP: valores iniciais 3) Dependência no tamanho das seqüências Crescimento do escore com o tamanho das seqüências GOP = GOP_origem + log(min(N,M)))* (escore médio de resíduos não casados) * (percentual de semelhança) ClustalW 17/06/2001

GAP: valores iniciais 4) Dependência na diferença do tamanho das seqüências Se uma seqüência é muito menor que a outra, GEP é aumentado para inibir muitos gaps longos na seqüência menor. GEP = GEP_origem * ( 1.0 + |log(N/M)| ) ClustalW 17/06/2001

GAP: penalidades localizadas Antes de cada alinhamento gera uma tabela de gaps para cada posição. 1) Diminuição da penalidade para gaps existentes Se já existe um gap na posição o GOP é reduzido em proporção ao número de seqüências com gap, e o GEP é diminuído pela metade. GOP = GOP*0.3*(No_seqüências_sem_gap/No_seqüências) ClustalW 17/06/2001

GAP: penalidades localizadas 2) Aumento da penalidade proximo a gaps existentes Se uma posição não possui gaps mas está a 8 residuos de um gap, o GOP é modificado para: GOP = GOP*(2 + ((8-distancia_do_gap)*2)/8) 3) Redução da penalidade em trecho hidrófilos Uma seqüência de 5 resíduos hidrófilos é considerada um trecho hidrófilo Se uma posição não há gaps e existe um trecho hidrófilo, o GOP é reduzido por um terço ClustalW 17/06/2001

GAP: penalidades localizadas 4) Penalidades especificas por resíduo Se não há trechos hidrófilos e não há gaps em uma posição então o GOP é multiplicado pela média números atribuídos a cada aparição do resíduo na posição Números provenientes da tabela de Pascarella e Argos com fatores de modificação do gap para cada resíduo ClustalW 17/06/2001

Matriz de Pesos Matrizes usadas para cálculo de similaridade entre amino ácidos Dados auxiliares Dependendo da semelhança entre as seqüências uma matriz mais “flexível” é escolhida Pode-se definir uma matriz a ser utilizada ClustalW 17/06/2001

Matriz de Pesos Séries DNA GONNET(default) BLOSUM(Heinkoff) [35-100%]: Gonnet80; [25-35%]: Gonnet120; [0-25%]: Gonnet250 BLOSUM(Heinkoff) [80-100%]: Blosum80; [60-80%]: Blosum62; [30-60%]: Blosum45; [0-30%]: Blosum30 PAM(Dayhoff) [80-100%]: Pam20; [60-80%]: Pam60; [40-60%]: Pam120; [0-40%]: Pam350 DNA IUB (BESTFIT) (padrão) CLUSTAL ClustalW 17/06/2001

Seqüências Divergentes Atrasar o alinhamento das seqüências mais divergentes para diminuir o erro na fase inicial do alinhamento ClustalW 17/06/2001

Exemplos ClustalW 17/06/2001

Referências Programas, documentação e artigos sobre Clustal-W e Clustal-X http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22(22):4673-4680. Eppstein, D.A. (1989) Efficient Algorithms for Sequence Analisys With Concave and Convex Gap Costs Neighbor-Joining http://www.biology.usu.edu/biol6750/Lecture_18.htm ClustalW 17/06/2001