Multiplicação Viral LabVir – ICBS - UFRGS

Multiplicação dos vírus “Evento central de existência e perpetuação dos vírus na natureza” Produzir progênie viável – Consequências “Nenhuma” (maioria dos vírus) Doença (Hepatites virais) Morte do hospedeiro (Ebola)

Conceitos básicos Infecção [infere: inserir, penetrar] - Em virologia: processo replicativo do agente como um todo, incluindo penetração e as etapas subsequentes da replicação. Infecção produtiva: todas as etapas completas resultando na progênie viral. Infecção abortiva: após a penetração , o ciclo replicativo for interrompido em alguma etapa. Susceptibilidade: capacidade das células de serem infectadas naturalmente pelo vírus. Permissividade: condições intracelulares para a ocorrência da multiplicação viral.

Espécies animais [também cultivos celulares] apresentam uma ampla variação de susceptibilidade a diferentes vírus. Tropismo: predileção do vírus por determinadas células, tecidos ou órgãos do hospedeiro para multiplicar. Hospedeiro Conjunto de espécies que podem ser infectadas naturalmente por um determinado vírus.

Etapas da Replicação 1- ADSORÇÃO 2- PENETRAÇÃO 3 - DESNUDAMENTO 4 – TRANSCRIÇÃO DOS GENES VIRAIS 5 – TRADUÇÃO DOS mRNA E PRODUÇÃO DAS PROTEÍNAS VIRAIS 6 – REPLICAÇÃO DO GENOMA 7 – MONTAGEM / MATURAÇÃO 8 – 9 - LIBERAÇÃO

Proteínas da superfície dos vírions ADSORÇÃO Ligação específica das partículas víricas na superfície das células hospedeiras. VAPs Proteínas da superfície dos vírions Receptores celulares

ADSORÇÃO Receptores celulares proteínas [glicoproteínas] ou carboidratos [presentes em glicoproteínas] Receptores específicos Rinovírus Vírus da febre aftosa Receptores alternativos [vantagens evolutivas] Herpesvírus Togavírus

ADSORÇÃO Receptores são determinantes na patogenia das infecções Interações químicas: Eletrostática Pontes de hidrogênio - +

Co-receptor: receptor de citocina ADSORÇÃO Em alguns casos a interação vírus e receptores não são suficientes para permitir o início da infecção. Co-receptores Interação vírus com proteínas adicionais da membrana celular HIV Receptor CD4 + Co-receptor: receptor de citocina CCR-5, CXCR-4

ADSORÇÃO

PENETRAÇÃO Transposição da membrana plasmática. Fusão na superfície celular: Retrovírus, herpesvírus [fusão do envelope na membrana celular] Penetração após endocitose: Penetração de vários vírus envelopados [flavivírus, ortomixovírus] Alguns sem envelope [Adenovírus, reovírus]

DESNUDAMENTO RNA Vírus DNA Refere-se a uma série de eventos que ocorrem após a penetração. Resultando na exposição parcial ou completa do genoma viral Vírus DNA RNA

DESNUDAMENTO TRANSCRIÇÃO TRADUÇÃO Após o desnudamento, exposição às enzimas e fatores de replicação: Vírus DNA e RNA de cadeia negativa: TRANSCRIÇÃO RNA de cadeia positiva: TRADUÇÃO

Movimentação intracelular Transporte até o local onde ocorrerão a expressão genica e a replicação. Forma passiva, no interior de vesículas endocíticas Interação com componentes do citoesqueleto Ou proteínas transportadoras Penetração nuclear Vírions pequenos, podem ser transportados intactos [parvovírus 18 – 24 nm] Vírions maiores, precisam ser previamente desintegrados ou deformados

Expressão gênica O genoma viral codifica diferentes proteínas que desempenham três funções básicas: Assegurar a replicação do genoma; Subverter funções celulares em seu benefício; Empacotar os genomas recém replicados em novas partículas víricas.

Replicação do genoma Dependendo do tipo e organização genômica, os vírus podem utilizar diferentes estratégias de expressão e replicação. Baltimore [1971]: classificação dos vírus em 6 grupos Tipo de genoma; Local e estratégia de replicação.

ds= double stranded (dupla fita) ss=single stranded (fita simples)

Maturação e egresso Formação das unidades estruturais do capsídeo pela interação entre as respectivas proteínas; Incorporação do genoma ao capsídeo pré-formado ou em formação; Liberação da progênie viral da célula infectada Morfogênese: montagem das partículas víricas. A capacidade infectiva = maturação

Liberados por lise celular Maturação Maturação intracelular Liberados por lise celular

Maturação Maturação por brotamento em membranas celulares

Liberação da célula Brotamento (com ou sem morte celular) Liberação por lise da célula (com ou sem efeito citopático)

CICLO DE MULTIPLICAÇÃO VIRAL Resumo: Adsorção – Penetração - Desnudamento Transcrição Tradução Funções do hospedeiro (+ou-) REPLICAÇÃO CICLO DE MULTIPLICAÇÃO VIRAL Montagem (Maturação) Liberação MULTIPLICAÇÃO

CULTURA DE CÉLULAS Cultura de células é o processo pelo qual células são mantidas vivas e em multiplicação fora de seu tecido original, em condições controladas.

Cultivos celulares - cultivos primários (células diplóides) - linhas celulares (diplóide, 40 passagens ) - células de linhagem (número de passagens indefinido)  

CULTIVO DE CÉLULAS Cultivo Primário Preparadas diretamente das células obtidas de um tecido de um organismo - Sensível a vírus - Resiste poucas passagens ( máximo 20) Em geral, essas células são mais sensíveis do que as linhagens celulares, ou seja, são capazes de detectar menores quantidades de vírus. Isso devese ao fato de que as células primarias são mais semelhantes as células do hospedeiro, por terem sido retiradas do animal há pouco tempo.

CULTURA DE CÉLULAS Células de linhagem – Derivadas de células tumorais Capacidade ilimitada de crescimento em cultura – Derivadas de células tumorais – Sofreram transformação espontânea ou induzida Algumas células sobrevivem Seguem multiplicando-se Tornam-se “imortais” As células de linhagem , por outro lado, foram colocadas em cultivo há muito tempo e provavelmente já sofreram muitas mutações ao longo do tempo em que vem sendo mantidas em laboratório. A contínua passagem de células em laboratório faz com que as mesmas fiquem cada vez mais distantes e diferentes das células das quais foram originadas. Cultivo primário senescente

CULTIVO DE VÍRUS IN VITRO - Garrafas de Vidro - Garrafas de Plástico - Garrafas fechadas ou abertas (CO2) Garrafas estacionárias ou rolantes Tubos de vidro ou plástico Tubos com lamínulas (tubos de Leighton) - Placas de microtécnica com 6, 12, 24, 96 orifícios

Tubos de cultivos celulares em equipamento rotativo Microplacas de cultivos celulares

EFEITO CITOPÁTICO (ECP): É o dano que o vírus causa à célula ! - infelizmente, nem todos os vírus causam danos às células! - a maioria não causa dano nenhum!

BVDV Rotavírus RSV FCV

EFEITO CITOPÁTICO (ECP): Herpes (coloração: violeta de genciana)

EFEITO CITOPÁTICO (ECP): Herpes (coloração: carbazol)

Microscopia eletrônica