Contribuições do Inmetro Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l Contribuições do Inmetro para a estruturação da Rede Nacional de Métodos Alternativos Parte 1 Luciene Bottentuit Balottin, D.Sc. Pesquisadora-Tecnologista em Metrologia e Qualidade

MÉTODOS ALTERNATIVOS AO USO DE ANIMAIS Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l MÉTODOS ALTERNATIVOS AO USO DE ANIMAIS Historicamente estas avaliações toxicológicas utilizavam somente modelos animais Toxicidade aguda Toxicidade crônica Irritação ocular Irritação dérmica Dermosensibilização Mutagenicidade Carcinogenicidade Toxicidade reprodutiva Toxicocinética Etc.

MÉTODOS ALTERNATIVOS AO USO DE ANIMAIS Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l MÉTODOS ALTERNATIVOS AO USO DE ANIMAIS Historicamente estas avaliações toxicológicas utilizavam somente modelos animais Toxicidade aguda Toxicidade crônica Irritação ocular Irritação dérmica Dermosensibilização Mutagenicidade Carcinogenicidade Toxicidade reprodutiva Toxicocinética Etc. Éticas John Draize, 1944

MÉTODOS ALTERNATIVOS AO USO DE ANIMAIS Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l MÉTODOS ALTERNATIVOS AO USO DE ANIMAIS Historicamente estas avaliações toxicológicas utilizavam somente modelos animais ENSAIO COM ANIMAIS X RESPOSTA EM HUMANOS

MÉTODOS ALTERNATIVOS AO USO DE ANIMAIS Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l MÉTODOS ALTERNATIVOS AO USO DE ANIMAIS 1957 – “Principles of Human Experimental Technique” Conceito 3Rs: Replacement Reduction Refinement Russell and Burch Toda abordagem experimental que contribuí para a substituição, redução ou refinamento dos ensaios com animais para avaliação de toxicológico são chamados métodos alternativos.

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Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l PANORAMA REGULATÓRIO Diretiva 2003/15/EEC de 27 de Fevereiro de 2003: Sétima emenda a Diretiva de Cosméticos(Directive 76/768/EEC). Diretiva 86/609/EEC de 24 de Novembro de 1986 referente à proteção dos animais utilizados para fins experimentais e outros fins científicos. 1991- European Center for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Proíbe a comercialização de cosméticos testados em animais (março 2013)

Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l PANORAMA REGULATÓRIO Regulamento (EC) No 1907/2006 de18 Decembro de 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH) Deadline 2018

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Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l PANORAMA REGULATÓRIO Lei Arouca (11.794, 08/10/2008) Cria o Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal – CONCEA Estabelece procedimentos para o uso de animais para fins de ensino e pesquisa científica Organiza o Sistema Nacional de Experimentação Animal Competências do CONCEA (Art 5, Lei 11.794/2008) Ações Regulatórias, consultivas e deliberativas Políticas e ações transversais Diagnóstico de métodos alternativos Aprovação de procedimentos e materiais de referência Monitorar e avaliar a introdução de métodos alternativos que substitua o uso de animais em ensino e pesquisa.

Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l PANORAMA REGULATÓRIO RESOLUÇÃO NORMATIVA Nº 17, DE 3 DE JULHO DE 2014 Esta Resolução Normativa dispõe sobre o reconhecimento no país de métodos alternativos validados que tenham por finalidade a redução, a substituição ou o refinamento do uso de animais em atividades de pesquisa, nos termos do inciso III do art. 5º da Lei nº 11.794, de 8 de outubro de 2008, e sua regulamentação.

Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l PANORAMA REGULATÓRIO RESOLUÇÃO NORMATIVA Nº 18, DE 24 DE SETEMBRO DE 2014 Art. 1º Esta Resolução Normativa reconhece o uso no país de métodos alternativos validados, que tenham por finalidade a redução e substituição ou o refinamento do uso de animais em atividades de pesquisa, nos termos do inciso III do art. 5º da Lei nº 11.794, de 08 de outubro de 2008, e sua regulamentação.   Art. 2º Para os efeitos desta Resolução Normativa, o CONCEA reconhece os 17 (dezessete) métodos alternativos agrupados nos 07 (sete) desfechos

Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l PANORAMA REGULATÓRIO Para avaliação do potencial de irritação e corrosão da pele o Concea reconhece o método OECD TG 430 – Corrosão dérmica in vitro: Teste de Resistência Elétrica Transcutânea; método OECD TG 431 – Corrosão dérmica in vitro: Teste da Epiderme Humana Reconstituída; o método OECD TG 435 – Teste de Barreira de Membrana in vitro; o método OECD TG 439 – Teste de Irritação Cutânea in vitro.   Para avaliação do potencial de irritação e corrosão ocular o Concea reconhece o método OECD TG 437 – Teste de Permeabilidade e Opacidade de Córnea Bovina; o método OECD TG 438 – Teste do Olho Isolado de Galinha; o método OECD TG 460 – Teste de Permeação de Fluoresceína. Para avaliação do potencial de fototoxicidade o Concea reconhece o método OECD TG 432 – Teste de Fototoxicidade in vitro 3T3 NRU. Para avaliação de absorção cutânea o Concea reconhece o método OECD TG 428 – Absorção Cutânea método in vitro.

Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l PANORAMA REGULATÓRIO Para avaliação do potencial de sensibilização cutânea o Concea reconhece o método OECD TG 429 – Sensibilização Cutânea: Ensaio do Linfonodo Local; o método OECD TG 442A e 442B – Versões não radioativas do Ensaio do Linfonodo Local.   Para avaliação de toxicidade aguda o Concea reconhece o método OECD TG 420 – Toxicidade Aguda Oral – Procedimento de Doses Fixas; o método OECD TG 423 – Toxicidade Aguda Oral – Classe Tóxica Aguda; o método OECD TG 425 – Toxicidade Aguda Oral – Procedimento “Up and Down”; o método OECD GD 129 – Estimativa da dose inicial para teste de toxicidade aguda oral sistêmica. Para avaliação de genotoxicidade o Concea reconhece o método OECD TG 487 – Teste do Micronúcleo em Célula de Mamífero in vitro.

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VALIDAÇÃO DE MÉTODOS E ACEITAÇÃO REGULATÓRIA Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l VALIDAÇÃO DE MÉTODOS E ACEITAÇÃO REGULATÓRIA Reliability is defined as the extent of reproducibility of results from a test within and among laboratories over time, when performed using the same standardised protocol. The relevance of a test method describes the relationship between the test and the effect in the target species and whether the test method is meaningful and useful for a defined purpose, with the limitations identified.

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VALIDAÇÃO DE MÉTODOS E ACEITAÇÃO REGULATÓRIA Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l VALIDAÇÃO DE MÉTODOS E ACEITAÇÃO REGULATÓRIA http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/oecdguidelinesforthetestingofchemicals.htm

TEST GUIDELINES – MÉTODOS IN VITRO Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l TEST GUIDELINES – MÉTODOS IN VITRO

TEST GUIDELINES – MÉTODOS IN VITRO Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l TEST GUIDELINES – MÉTODOS IN VITRO Fototoxicidade in vitro –TG 432- Determina a toxicidade de substâncias após sua exposição à luz solar (fototoxicidade). Duas placas semeadas com o modelo teste são tratadas por 1hora com oito concentrações da substância teste. Cultivo por 24horas à 370C, 5% CO2 Simulador Solar Placa A UVA 5 J/cm2 Viabilidade Celular aferida pela captação do vermelho Neutro Cálculo de IC50 +UVA e IC50 -UVA Irradiação Placa B Mantida no escuro PIF< 2 ou MPE < 0.1– não fototóxico PIF>2 e < 5 ou MPE >0.1 e < 0.15 – provável fototoxicidade PIF>5 ou MPE > 0.15 - Fototoxicidade

TEST GUIDELINES – MÉTODOS IN VITRO Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l TEST GUIDELINES – MÉTODOS IN VITRO A B Figura 1- Exemplo de fibroblastos Murinos 3T3 antes (A) e depois da exposição ao vermelho Neutro (VN). Exemplo de células viáveis, repletas de VN no citoplasma podem ser vistas em B. 540nm