GLICOSE PIRUVATO VIAS LINEARES (glicólise e gliconeogênese)

Ciclo do ácido cítrico ou ciclo de Krebs representa o estágio final da oxidação de fontes de energia metabólica (carbohidratos, ácidos graxos e aminoácidos) = rota central de recuperação de energia a partir de vários combustiveis meta- -bólicos VIA CIRCULAR

Coloca o substrato Papel de filtro com KOH Tecido Meio de cultura Fluido com cor KOH + CO 2 KHCO 3 CO 2 KHCO 3 Pressão no frasco Leitura do líquido O manômetro de Otto Warburg Era usado para medir a produção de CO 2. - Permitia determinar a estequiometria das reações.

Glicose + 6O 2 6CO 2 + 6H 2 O

Os experimentos de Hans Krebs - Observando os dados disponíveis na época Krebs destaca os trabalhos de Thumberg entre 1906 e 1920 usando tecidos musculares. Ele testou a oxidação de cerca de 60 substâncias orgânicas e descobriu que a forma ionizada de vários ácidos como o lactato (1 carboxila), succinato, fumarato, malato (2 carboxilas), eram rapidamente oxidadas. - Krebs então testa outros ácidos dicarboxílicos. Em 1935 descobre que um deles, o α-cetoglutarato, com 5 carbonos, assim como nos experimentos de Szent-Györgyi, aceleravam a produção de CO 2 e não eram consumidos na reação lactato succinato malato fumarato piruvato + tempo CO 2

- Em 1937 Krebs testa ácidos tricarboxílicos como citrato, isocitrato e aconitato, agora com 6 carbonos, e observa que a produção de CO 2 também era estimulada e esses intermediários não eram consumidos.

- Segundo Krebs, outra contribuição significativa para suas descobertas veio dos estudos de Martius e Knoop, em 1937, que elucidaram a transformação oxidativa de citrato até α-cetoglutarato. - Krebs observou nos trabalhos de Shiffield em 1937 que a formação de citrato (C6) ocorria rapidamente após a adição de oxaloacetato (C4) em diversos tecidos. Concluiu então que a formação desse composto de 6 carbonos poderia se originar da ligação de um produto de 4 carbonos (oxaloacetato) mais dois carbonos vindos provavelmente da degradação da glicose. - Juntando as seguintes informações: 1- ácidos di e tri carboxílicos aceleravam a formação de CO 2 em diversos tecidos mas não eram consumidos na reação. 2- algum composto de 2 carbonos vindo provavelmente da glicólise se combinava com oxaloacetato e formava um composto de 6 carbonos (citrato) que iniciava uma via de interconversão, Krebs conclui e postula um modelo que ele chamou de “Ciclo do Ácido Cítrico” ou dos “Ácidos Tricarboxílicos”. Em 1936, Carl Martius e Franz Knoop demonstraram que o citrato pode ser formado de modo não-enzimático a partir do oxaloacetato e do piruvato

- Krebs observou nos trabalhos de Shiffield em 1937 que a formação de citrato (C6) ocorria rapidamente após a adição de oxaloacetato (C4) em diversos tecidos. Concluiu então que a formação desse composto de 6 carbonos poderia se originar da ligação de um produto de 4 carbonos (oxaloacetato) mais dois carbonos vindos provavelmente da degradação da glicose. - Juntando as seguintes informações: 1- ácidos di e tri carboxílicos aceleravam a formação de CO 2 em diversos tecidos mas não eram consumidos na reação. 2- algum composto de 2 carbonos vindo provavelmente da glicólise se combinava com oxaloacetato e formava um composto de 6 carbonos (citrato) que iniciava uma via de interconversão, Krebs conclui e postula um modelo que ele chamou de “Ciclo do Ácido Cítrico” ou dos “Ácidos Tricarboxílicos”.

Krebs então postula que: “O piruvato, ou um derivado vindo da glicólise (acetato), se condensa com o oxaloacetato e forma citrato. Por uma sequência de reações que envolvem cis-aconitato, isocitrato, α-cetoglutarato, succinato, fumarato, malato e oxaloacetato como intermediários, um ácido acético é oxidado e o oxaloacetato necessário para a reação inicial de condensação é regenerado. Isso explica a ação catalítica dos ácidos di e tricarboxílicos (de 4,5 e6 carbonos), bem como a capacidade que esses ácidos possuem de se oxidar nos tecidos que oxidam carboidratos.”

Ciclo do ácido cítrico ou ciclo de krebs

Os experimentos de Fritz Lipmann - Naquela época já se sabia que a Coenzima A estava envolvida em reações de transferência de carbono e que ela era derivado do ácido pantotênico, uma vitamina pertencente ao complexo B (vit. B5). - A coenzima A é uma molécula ubíqua nos tecidos Ac. Pantotênico = Vit. B5

- A síntese de citrato aumenta na presença de CoA

- Lipmann demonstra que o consumo de O 2 é aumentado na presença de CoA quando se fornece glicose-fosfato para leveduras

O complexo Piruvato Desidrogenase Três tipos de enzimas em cópias múltiplas: E1, E2, E3 Ex: piruvato desidrogenase de E. coli contém 60 s-u proteícas Complexo multienzimático: grupos de enzimas associadas de modo não- covalente que catalisam duas ou mais reações seqüencias em uma rota metabólica (aumento a velocidade das reações, canalização dos intermediários minimizando as reações secundárias, controle coordenado das reações catalisadas)

Descarboxilação oxidativa Complexo piruvato desidrogenase: E1= piruvato desidrogenase (24 s-u) E2= dihidrolipoil transacetilase (24 s-u) E3= dihidrolipoil desidrogenase (12 s-u) E. coli diâmetro de ~300 Å > ribossomaÅ

4 vitaminas são necessárias para formação de Acetil-CoA Riboflavina = Vitamina B2 Ácido nicotínico = Vitamina B3 tiamina = Vitamina B1 lipoamida

Falta de vitamina B1 – tiamina – causa uma doença conhecia por beriberi

Hidroxietil-TPP

Lipoamido = ac. Lipóico ligado A um resíduo lisina

Transesterificação e produção da AcetilCoA Acetil- dihidropoliamido

dihidropoliamido

Regeneração do lipoamido

O complexo piruvato desidrogenase pode ser inibido pela reação do grupo lipoamido com compostos que contêm arsênico

E1= piruvato desidrogenase Piruvato + TPP Hidroxietil-TPP + CO2 Hidroxietil-TPP + lipoil-lisina oxidada TPP + Acetil tioester da lipoil-lisina reduzida E2= dihidrolipoil transacetilase Acetil tioester da lipoil-lisina reduzida + CoA Acetil-CoA + lipoil lisina reduzida E2= dihidrolipoil transacetilase E3= dihidrolipoil desidrogenase: restauração do complexo PDH ao seu estado inicial (regeneração da lipoamida oxidada e produção de FADH2)

Regulação do complexo PDC Inibida quando [ATP/ADP], [NADH/NAD+] e [acetilCoA/CoA] Inibida por ácido graxos de cadeia longa (mod. alostérica) Por modificação covalente de E1 (mamíferos): - piruvato desidrogenase cinase fosforila E1 inativa o PDC (ATP é um ativador alost. desta cinase) - piruvato desidrogenase fosfatase : reativa o PDC A insulina reverte essa inativação ativando a PD fosfatase promovendo a síntese de acetil-CoA Complexo multienzimático: grupo de enzimas associadas de modo não-covalente que catalisam duas ou mais reações sequenciais em uma rota metabólica. Vantagens: -velocidade das reções limitada pela difusão do substrato entre os sítios ativos -canalização dos intermediários metabólicos evitando reações secundárias -contrôle coordenado das reações no complexo mutienzimático

As Reações do Ciclo de Krebs Piruvato NAD + NADH CO 2 CoA-SH Mitocôndria

1° Reação: 2° Reação: A enzima possui um centro Fe-S importante para sua catálise que a torna muito susceptível ao estresse oxidativo. 3° Reação: Ocorre a primeira descarboxilação oxidativa com liberação com conservação de energia na forma de NADH 4° Reação: Ocorre outra descarboxilação oxidativa com conservação de energia. A catálise do complexo α-cetoglutarato desidrogenase é similar ao da piruvato desidrogenase

Sintase: reação de condensação sem nucleosídeo trifosfato (ATP, GTP...) ou outra origem de energia

Importância da ligação tioester

Citrato sintase Oxaloacetato (em amarelo) é o primeiro substrato a se ligar, e promove uma mudança conformacional, criando um sítio de ligação para o segundo substrato, o Acetil-CoA (em vermelho um análogo da Acetil-CoA) = reação cinética seqüencial ordenada

Aconitase contêm um grupo ferro-enxofre 4Fe-4S

O CO 2 eliminado vem do OAA não do acetil-CoA

Perda do grupo carboxila na forma de CO 2 e En. de oxidação conservada na ligação tioéster

5° Reação: 6° Reação: Ocorre conservação de energia na forma de FAD reduzido. A succinato desidrogenase é a única enzima do TCA que está ligada à matriz mitocondrial 7° Reação: 8° Reação:

En. livre de hidrólise da ligação tioéster do succinil-CoA forte e negativa (-36 kJ/mol)

Sintetase: reação de condensação com uso de nucleosídeos trifosfato Fosforilação ao nível do substrato (diferente das fosforilação oxidativa) = anidro fosfato de alta energia

Catalise a desidrogenação estereoespecífica do succinato em fumarato

Malonato= inibidor competitivo

Etapa final do ciclo com regeneração do oxaloacetato

3 NADH 1 FADH 2 1 GTP ou ATP Reações anapleróticas repõem os intermediários Componentes do TCA são importantes intermediários anabólicos Saldo final – Cada molécula de Acetil-CoA que entra no ciclo gera:

O catabolismo de proteínas gera diversos intermediários do TCA Reações anapleróticas repõem intermediários metabólicos importantes para o TCA

Regulação do Ciclo de Krebs No músculo cardáco o flúxo de metabólitos no TCA é proporcinal a taxa de consumo de oxigênio : Piruvato carboxilase Diabetes e formação dos corpos cetónicos... 3 níveis de regulação: -Disponibilidade de Substrao -Inibição por acumulo de Produto -Inibição competitiva retroativa pelos intermediários Velocidades da glicólise e do CK são reguladas de maneira integrada (NADH, ATP, Citrato)