Avaliação da produção de giberelina pelo fungo Moniliophthora perniciosa durante a interação com cacaueiro Alinne Batista Ambrósio Orientador: Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira Co-orientadora: Dra. Odalys García

SUMÁRIO - Doença vassoura-de-bruxa - Hormônios vegetais Introdução - Doença vassoura-de-bruxa - Hormônios vegetais - Por que a giberelina? Objetivos Metodologia Resultados preliminares Riscos

INTRODUÇÃO Vassoura-de-bruxa AIME AND PHILLIPS-MORA, 2005.

- Frutos partenocárpicos Introdução Sintomas - Hipertrofia - Hiperplasia - Superbrotamento - Frutos partenocárpicos

Introdução Hormônios vegetais auxina giberelina citocininas . etileno citocininas ácido abscísico

Introdução Desbalanço hormonal Hospedeiro Patógeno DH Doença

- O patógeno pode alterar diretamente o metabolismo dos fitohormônios Introdução Desbalanço hormonal - O patógeno pode alterar diretamente o metabolismo dos fitohormônios produzidos pela planta

Introdução Desbalanço hormonal - Patógenos de plantas são capazes de eles mesmos produzirem fitohormônios

Introdução Desbalanço hormonal

Introdução Na vassoura-de-bruxa Produção Alteração

Divisão de células meristemáticas Introdução POR QUE GIBERELINA? Giberelina ativa a divisão celular GAs CDKs G1 >>> S G2 >>> M Divisão de células meristemáticas

Introdução POR QUE GIBERELINA? A giberelina induz a elongação de tecidos intactos da planta mediados por proteínas, como expansinas e xiloglucano endotransglicosilase (XET) GAs Expansinas e XET Afrouxamento da parede celular Aumento do tamanho da célula Na apresentação falar sobre os teste e colocar o slide da paredde

Introdução POR QUE GIBERELINA? XET Expansinas

Introdução POR QUE GIBERELINA? A giberelina induz a expressão de invertases e amilases Planta sadia Me = medula Mu = canal de mucilagem Me Mu Planta infectada Esquema das amilases e comentar q numa planta sadia isso seria p ativação de um dreno (fruto) disponibilizando açucares soluveis

Sintomas Introdução Depois açucares falar tb de Outra observação interessante é que em muitas plantas a giberelina leva a uma inibição do florescimento, fenômeno efetivamente verificado em plantas infectadas, e talvez a maior causa da quebra da produção. É curioso notar que tem sido conseguida a indução do florescimento do cacau a partir do uso de inibidores de giberelina, como o paclobutrazol (M.W.Müller), reforçando essa possibilidade.

Tratamento de sementes de arroz com extrato de esporos de M Tratamento de sementes de arroz com extrato de esporos de M. perniciosa em comparação com tratamento com giberelina.

Introdução Tratamento de plântulas de cacau com extrato de esporos de M. perniciosa

Introdução Giberelina Gibberella fujikuroi GAs são diterpenóides Gibberella fujikuroi Hormônio vegetal que está envolvido na regulação do crescimento e desenvolvimento da planta, incluindo germinação de sementes, crescimento do caule, indução de floração e maturação de frutos 136 GAs vêm sendo identificadas em plantas, fungos e bactérias Conta historia da descoberta no fungo e na planta (fungo ascomiceto patógeno que produz planta boba em arroz) Em 19...

Introdução Giberelinas ativas

Introdução ggs2 CPS / KS P450-4 P450-1 P450-1 P450-1 P450-1 e 2 ent-Kaurene Geranylgeranyl diphosphate ggs2 CPS / KS P450-4 ent-7alpha-Hydroxy- kauroic acid ent-Kaurenoic acid Gibberellin A12 aldehyde P450-1 P450-1 P450-1 Gibberellin A7 Gibberellin A4 Gibberellin A14 aldehyde P450-1 e 2 GA4 desaturase

Clusterização/singlets banco M. perniciosa Introdução Gene Clusterização/singlets banco M. perniciosa BLAST NR bp total E value GA4 desaturase CP02-S3-038-509-B10-E.F Gibberella fujikuroi des gene for GA4 desaturase --- 0.0 P450-4 CP02-S2-040-354-G04-M.F CP02-S3-038-547-G02-S.F CP02-PF-096-002-E07-C.G cytochrome P450-4 (ent-kaurene oxidase) 898 770 942 2e-12 4e-16 4e-13 P450-1 CP02-S2-038-269-G11-M.F cytochrome P450-1 (GA14-synthase 914 2e-15 ggds CP02-S2-032-338-A12-E.F CP02-S3-033-416-E10-C.G geranylgeranyl diphosphate synthase 538 909 1e-21 2e-17 P450-2 CP02-S3-040-626-G08-C.F P450II GA20 oxidase 1041 2e-16 GfCPS/KS CP02-S3-000-110-H11-C.F GfCPS/KS [Gibberella fujikuroi] 1019 1e-09 P450 -3 CP02-S2-000-144-G06-L.H cytochrome P450 -3 C13 oxidase) 569 3e-20 DELLA BINT-RT-001-014-B09-E.F BIEM-NT-001-006-F10-E.F GIA/RGA-like gibberellin response modulator 657 894 2e-42 4e-43 Cdc2 BINT-SP-001-017-A07-E.F BINT-SP-001-050-B02-E.F putative receptor-like serine-threonine protein kinase 624 527 4e-68 1e-53 GID1 receptor BINT-SP-001-023-C09-E.F Gibberellin receptor GID1 (Gibberellin-insensitive dwarf protein 1) 8e-14 Marcar os reads repetidos p p450 por ser uma familia muito ampla (geralmente são multifuncionais) dificultando as analises

Introdução CPS-KS G4 des GGPP 276 42 505 952 aa Contig8670 Contig15446 182 CPS-KS 22 1 342 aa 278 G4 des Contig13951 Contig2062 Colocar fotos do gel. Falar do sequenciamento p confirmação dos genes. 1 4 392 aa 333 GGPP Contig14680 Contig7333

Manejo de nitrogênio na lavoura de cacau - Edvaldo Introdução Manejo de nitrogênio na lavoura de cacau - Edvaldo A adubação das plantas de cacau com uréia poucas semanas antes do pico de esporulação do fungo é uma das principais práticas desenvolvidas. Lavoura de Edvaldo Lavoura do vizinho

Regulação da síntese de giberelina Introdução Regulação da síntese de giberelina . Nitrogênio AREA (NIT2) GAs

Introdução

Hipótese de trabalho M. perniciosa na fase é capaz de sintetizar giberelina que deve produzir um desbalanço hormonal no cacaueiro criando as condições favoráveis para o estabelecimento do fungo e o desenvolvimento da doença. Testar a hipótese formulada é algo fundamental para a compreensão da doença Vassoura-de-bruxa. Se ela for verdadeira, teremos conseguido a chave para o controle do problema através do manejo do nitrogênio na planta.

Estudos de complementação de mutantes funcionais Mapeamento físico Quantificação da produção de giberelina durante a interação e a partir de sobrenadante do fungo (biotrofico e necrotrofico) Analise de expressão dos genes em diferentes fases do ciclo de vida (esporos, micelio biotrofico e micelio necrotrofico) Estudos de complementação de mutantes funcionais OBJETIVOS

METODOLOGIAS Pulse field e Southern blot Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS) Real -Time PCR Falar do q já foi feito e das dificuldades. Colocar o protocolo Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

METODOLOGIAS Complementação de mutantes (Transformação dos mutantes de G. funjikuroi ) - Race – PCR - Screening dos genes da síntese de GA em biblioteca de M. perniciosa em fago lambda EMBL3/BamH I Figura RACE

RACE - PRC

RACE - PRC PCR  Hind III 5’ / CPS-KS (1) 5’ / CPS-KS (2) 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8  Hind III 5’ / CPS-KS (1) 5’ / CPS-KS (2) CPS-KS (3) / 3’ 5’ / G4 (1) G4 (2) / 3’ 5’ / GGPP (1) GGPP (2) / 3’

RESULTADOS PRELIMINARES Teste expressão  Hind III cDNA necrotrófico cDNA biotrófico DNA genômico Controle negativo G4-des GGPP 1 2 3 4 6 5 9 7 8

RESULTADOS PRELIMINARES Teste expressão 1 2 3 4 6 5 9 7 8  Hind III cDNA necrotrófico cDNA biotrófico DNA genômico Controle negativo G4-des CPS-KS

Screening de biblioteca de fagos com sonda CPS-KS RESULTADOS PRELIMINARES Screening de biblioteca de fagos com sonda CPS-KS O vai fazer c isso

RESULTADOS PRELIMINARES Identificação e quantificação de giberelinas durante interação - Extratos de plantas diferentes (resistente e susceptível) - Diferentes partes da planta - Diferentes estádios Identificação e quantificação de giberelinas do sobrenadante - colaboração com grupos de pesquisa da Argentina

RISCOS A expressão gênica não é evidencia de que o fungo produza o composto ativo Complexidade da caracterização de hormônios vegetais (em especial de giberelinas) devido à diversidade de precursores e de rotas biossíntéticas No Brasil não existem grupos estabelecidos com experiência na quantificação e identificação de giberelinas e existem poucos grupos com essa especialidade no mundo